超声波辅助提取红枣中黄酮类物质的研究

刘秀敏，单春会，2，张雪，刘娅，3*

（1.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000；2.新疆特色果蔬贮藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000；3.新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832000）

红枣系鼠李科植物的果实，自古以来与桃、李、杏、栗并称“中国五果”[1]，其富含糖类、膳食纤维、蛋白质、维生素等多种营养成分及黄酮、多酚、多糖、皂苷等生物活性成分[2]，是一种天然的药食同源食品[3]。已有研究表明黄酮类化合物是最具活性的天然产物之一[4]，对人体生命健康起着重要作用[5]，具有抗病毒、抗过敏、降血脂、预防心脑血管疾病、抗菌消炎等功效[6-8]。

目前黄酮类物质主要以甲醇、乙醇和乙酸乙酯等有机溶剂提取，工艺要求苛刻，高温条件和大量有机溶剂的使用使得黄酮类化合物易发生电离、水解和氧化而失活[9]，有毒有机溶剂的使用还会导致环境问题并增加人类健康风险[10]。低共熔溶剂（deep eutectic sol－vent，DES）作为一种新型绿色提取溶剂，因具有原料易得、无毒性、成本低、可生物降解且能精准调节和设计等优势[11-14]，目前已经成功用于黄酮[15]、酚酸[16]、花青素[17]、多酚[18]、多糖[19]等多种生物活性成分的提取。因此，本文针对新疆丰富的红枣资源，辅以高效的超声波技术，利用低共熔溶剂提取红枣中的黄酮类物质，旨在提高红枣的附加值，为新疆红枣产业的绿色可持续发展提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣：产自新疆石河子；氯化胆碱、芦丁标准品（纯度＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；尿素、氢氧化钠：天津市化学试剂三厂；亚硝酸钠：天津市巴斯夫化工有限公司；硝酸铝：天津市北联精细化学品开发有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GL-20G-Ⅱ高速离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；JP-1000B-2高速多功能粉碎机：永康市永久工贸有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；WD-2102A酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；SK5200BT超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低共熔溶剂的配制

按照一定的摩尔比称取氯化胆碱和尿素，加入一定量的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌，直至形成均匀透明的液体，冷却至室温25℃备用[20]。

1.3.2 红枣中黄酮的提取

将红枣片粉碎过40目筛，4℃冷藏备用。称取一定质量的红枣粉，按照一定料液比与DES均匀混合，进行超声波辅助提取（200 W，35 kHz），然后以6 000 r/min离心10 min，取上清液即为红枣黄酮提取液。

1.3.3 单因素试验

准确称取0.5 g红枣粉，分别考察低共熔溶剂（氯化胆碱∶尿素）的摩尔比（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）、加水量（10%、20%、30%、50%、70%、90%）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）]、超声温度（45、50、55、60、65、70 ℃）、超声时间（10、20、30、40、50、60 min）对黄酮得率及总还原力的影响。

1.3.4 响应面试验

根据单因素试验结果，以加水量、料液比、超声温度、超声时间4个因素为自变量，黄酮得率（Y）为响应值，利用Box-Behnken设计四因素三水平的试验[21]，试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 黄酮含量测定和黄酮得率的计算

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定黄酮含量[22]。精密称取芦丁对照品，用60%乙醇配制成0.10 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别准确吸取标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 支 10 mL 具塞刻度试管中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min；再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min，然后加入4.0 mL 4%氢氧化钠溶液，最后加蒸馏水定容至10 mL，摇匀后静置15 min。在510 nm波长下测其吸光度，根据芦丁浓度和吸光度绘制标准曲线。黄酮测定方法为取1 mL样品溶液至10 mL具塞刻度试管中，后续操作按照标准曲线方法进行，黄酮得率计算公式如下。

式中：X为将测得吸光值代入标曲后计算得出的黄酮质量浓度，mg/mL；V0为提取液定容后的体积，mL；V1为测吸光值时所用提取液的体积，mL；V2为待测提取液总体积，mL；m为红枣粉质量，g；W为黄酮得率，mg/g。

1.3.6 总还原力测定

参照文献[23]的方法测定总还原力。分别取浓度为0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL 样品溶液 1.0 mL，分别加入0.2 mol/L（pH 6.6）的磷酸盐缓冲溶液（phos phatebuffersaline，PBS）0.2mL和1%氰化钾溶液 0.5mL，摇匀后置于50℃水浴中反应20 min，反应结束后用流动水迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL终止反应。然后在5 000 r/min下离心10 min，取1.5 mL上清液于试管中，加入1%三氯化铁溶液0.2 mL和蒸馏水3 mL，摇匀后静置8 min，在700 nm处测定吸光度，平行测定3次，取平均值，以VC作阳性对照。吸光值越大则代表样品还原能力越强。

1.4 数据处理

采用Origin8.5软件做图，Design-Expert 8.0.6软件进行方差显著性处理和分析，测定数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 氯化胆碱与尿素的摩尔比对黄酮得率的影响

氯化胆碱与尿素的摩尔比对黄酮得率的影响见图1。

图1 氯化胆碱与尿素的摩尔比对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of molar ratio of choline chloride to urea on the yield of flavonoids

由图1可以看出，当DES体系中的氢键受体氯化胆碱与氢键供体尿素的摩尔比为2∶1，此时黄酮得率最高。这可能是因为DES体系是一种弱碱性溶液，DES的pH值可通过影响DES与溶质分子之间的静电键和氢键相互作用而在提取中起重要作用。由于存在酚羟基，黄酮类化合物通常具有弱酸性，也增加一定溶解能力。当DES组分摩尔比改变时，会极大影响体系极性、pH值、黏度、密度、折光率等理化性质[24]，从而影响黄酮提取效率。因此选择氯化胆碱与尿素的摩尔比为2∶1进行后续研究。

2.1.2 DES的加水量对黄酮得率的影响

DES的加水量对黄酮得率的影响见图2。

图2 加水量对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of adding water on the yield of flavonoids

由图2可知，加水量对黄酮得率影响很大，DES加水量为50%时黄酮得率最高。加水量低于50%时，黄酮得率随加水量增加呈现上升趋势，可能是因为氯化胆碱与尿素构建的DES体系在室温25℃下具有很高黏度（428 mPa·s）[10]，而加水量增加至 50%，体系黏度显著降低[25]，大大提高了DES溶液的传质效率，从而提高黄酮得率。加水量高于50%后，会增加DES的极性，而极性的增加不利于黄酮类物质提取，因此得率明显下降。

2.1.3 料液比对黄酮得率的影响

料液比对黄酮得率的影响见图3。

图3 不同料液比对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

由图3可知，随着溶剂用量的增加，黄酮得率呈上升趋势。提取溶剂用量的增加，会加大红枣粉与提取剂的接触面积，从而加快红枣粉中黄酮向提取溶剂的质量转移，从而提高得率。料液比从1∶35（g/mL）至1∶40（g/mL）时，得率增加速率显著下降，这可能是因为提取溶剂的增多反而起到了稀释作用，并且增加其它物质的析出，影响得率。因此从经济节约的角度选择料液比 1∶35（g/mL）进行后续研究。

2.1.4 超声温度对黄酮得率的影响

超声温度对黄酮得率的影响见图4。

图4 不同超声温度对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of different ultrasonic temperature on the yield of flavonoids

由图4可知，黄酮得率随着超声温度的升高而增大。升高温度，会降低DES体系的黏度，增加红枣粉的分散性，加速溶质的传质作用，有利于有效成分的析出[25]。温度的升高虽有利于黄酮的提取，但高温也会破坏黄酮类化合物的活性，使其氧化、水解、电离[9]。因此从经济节约的角度选择超声温度为65℃进行后续研究。

2.1.5 超声时间对黄酮得率的影响

超声时间对黄酮得率的影响见图5。

图5 不同超声时间对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the yield of flavonoids

随着超声时间的增加，黄酮得率呈上升趋势，这是由于超声波的空化效应和机械效应，能够增大物质分子运动频率和速度，从而加速溶质的扩散和传播，使有效成分易溶出。从图5可知，超声时间从40 min增至60 min时，上升速率明显下降，其原因可能是超声时间过长，样品组织中其它物质会扩散出来，并附着于样品表面，阻碍样品与溶剂接触，从而影响提取效率。因此选择超声时间50 min为宜。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

以单因素试验结果为基础，设计响应面优化试验。响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface experiment results

续表2 响应面试验结果Continue table 2 Response surface experiment results

利用Design-Expert 8.0.6软件，对试验数据进行多元回归模型拟合，得到回归方程：Y=5.63-0.083A+0.10B+0.19C-8.061×103D+0.053AB-0.16AC+0.18AD+0.15BC+0.058BD-0.12CD-0.42A2-0.11B2-0.068C2-0.041D2。对回归方程进行显著性检验及方差分析。

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface regression model

由表 3可知，模型相关系数 R2=0.959 4，P＜0.01，说明该响应面模型极显著，模型能解释95.94%响应值的变化，模型拟合程度较好。且失拟项为0.073 0不显著（P＞0.05）。模型R2Adj=0.918 7，说明不确定因素对试验结果干扰较小，仅有总变异的8.13%不能用此模型解释。一次项 A、B、C 影响极显著（P＜0.01）；交互项 AC、BC、CD 影响极显著（P＜0.01）；A2、B2影响极显著（P＜0.01），C2影响显著（P＜0.05）。根据 F 值可知各因素对黄酮得率影响程度的大小顺序为超声温度＞料液比＞加水量＞超声时间。

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用响应面图见图6。

图6 各因素交互作用的响应面图Fig.6 Response surface plots showing the mutual effects of different factors

响应面曲面图的曲面越陡峭，说明该因素对黄酮得率影响越大。由图6可明显看出，A（加水量）及 C（超声温度）、B（料液比）及 C（超声温度）、C（超声温度）及D（超声时间）的交互作用的曲面有较大的倾斜度，说明这些交互项对红枣黄酮得率影响较大。

2.2.3 验证试验

根据优化得出的最佳条件为加水量45.28%，料液比 1∶40（g/mL），超声温度 69.99 ℃，超声时间 43.92 min。考虑到操作条件的可行性，最终将试验条件调整为加水量 45%，料液比 1∶40（g/mL），超声温度 70 ℃，超声时间44 min，进行回归模型有效性验证，此时黄酮得率为5.79 mg/g，该值和理论值（5.95 mg/g）基本一致，表明采用Box-Behnken分析法优化红枣中黄酮的提取工艺可行。

2.3 总还原力的测定结果

总还原力的测定结果见图7。

图7 红枣黄酮总还原力的变化Fig.7 Changes of total reduction ability of jujube flavonoids

由图7可知，不同质量浓度的红枣黄酮均表现出一定的总还原力，且总还原力随其质量浓度的增大而增强。总体VC还原力比样品总还原力要强，其主要原因是作为阳性对照的VC为纯品，而本文提取得到的仅为粗品黄酮，并未进一步分离纯化。但仍可以发现，红枣中的黄酮具有较好的还原能力。

3 结论

本文以红枣为研究对象，以氯化胆碱与尿素构建的DES为提取溶剂，研究氯化胆碱与尿素的摩尔比、加水量、料液比、超声温度、超声时间对红枣中的黄酮得率及总还原力的影响。通过响应面优化试验确定黄酮提取的最佳工艺参数：氯化胆碱与尿素摩尔比为2∶1，加水量 45%，料液比 1∶40（g/mL），超声温度 70 ℃，超声时间44 min，此时黄酮得率为5.79 mg/g。红枣中黄酮的总还原力随浓度增加而增大，红枣黄酮粗提液具有较好还原力。