分子量对蜜蜂巢脾多糖抑菌及抗氧化活性影响

◎ 周 杨，胡嘉琪，赵纯曦，朱 祺，殷 玲

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，其中多糖是巢脾中的主要活性成分[1-2]。蜜蜂巢脾多糖来源复杂，源于巢脾是蜜蜂世代栖息和繁衍的场所，也是蜜蜂贮存蜂蜜、花粉、蜂王浆、蜂胶的场所，老巢脾中残留大量蜂产品、幼虫茧衣及其分泌物，因此巢脾多糖很可能是动植物多糖的复合物[3]。研究前期发现巢脾多糖具有较好的抗氧化活性、抗脂质氧化活性、对于环磷酰胺对小鼠造成的免疫抑制也有一定的免疫调节活性。课题组前期研究发现，巢脾多糖有较好的抗氧化活性[4]，而多糖的生物学活性受到多糖分子量的影响。为进一步分析不同分子量巢脾多糖的生物活性，本试验采用超滤法对巢脾多糖进行分级分离，获得分子量为 4 ～ 100 kDa（HCP-L） 和 ＞ 100 kDa（HCP-H）2个不同分子量段的巢脾多糖，并对2个分子量段巢脾多糖的抗氧化活性及抑菌活性进行比较分析，以期筛选出活性更好的巢脾多糖组分，从而为进一步研究蜜蜂巢脾多糖的生物活性及开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西方蜜蜂老巢脾（使用3年以上）。

抗超氧阴离子测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒、总抗氧化测定试剂盒，均购自南京建成生物制药研究所。

无水乙醇（无锡佳妮化工有限公司）、硫化钡（国药集团化学试剂有限公司）、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）、硫酸（国药集团化学试剂有限公司）等均为分析纯。

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌均为购自中国药品生物制品菌检定所的冻干粉。

1.2 仪器与设备

MSC300超滤杯及截留分子量为4 kDa、100 kDa的超滤膜，上海魔速科学器材有限公司；紫外可见分光光度计T6，北京普析通用仪器有限公司；双光束紫外可见分光光度TU-1901，北京普析通用仪器有限公司；双人单面垂直净化工作台 SW-CJ-2FD，吴江市亚泰净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂巢脾多糖的提取及分级

粉碎的蜜蜂巢脾→按1∶15比例加入蒸馏水→50 ℃水浴锅水浴90 min→120目纱布过滤→重复3次→浓缩至体积大幅度减少→冷却离心→1∶4无水乙醇→4 ℃静置过夜→沉淀离心得蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白得蜜蜂巢脾多糖→依次使用截留分子量的为4 kDa、100 kDa的超滤膜超滤→获得分子量为4～100 kDa（HCP-L）、＞100 kDa（HCP-H）的多糖样品。

1.3.2 体外抗氧化能力检测

按照试剂盒方法测定各分子量段的巢脾多糖体外抑制羟自由基能力、抗超氧阴离子能力及总抗氧化能力。

1.3.3 巢脾多糖的抑菌性试验

菌种复苏并传2代后，挑取细菌菌落置10 mL血清肉汤培养基于37 ℃恒温摇床培养24 h，取出离心（2 000 r·min-1，10 min），用无菌生理盐水洗涤，采用麦氏比浊法用无菌生理盐水参照[9]的方法稀释成不同浓度悬菌液，以青霉素钾溶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，采用纸片扩散法[5]测定两组巢脾多糖的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖溶液对供试菌的抑菌性

2.1.1 蜜蜂巢脾多糖对肺炎链球菌的抑菌性

以滤纸片周围抑菌圈的直径大小作为巢脾多糖抑菌效果的测定指标，用游标卡尺测量培养皿中滤纸片对1×108CFU·mL-1的肺炎链球菌的抑菌圈直径（包含滤纸片的直径6 mm，下同）。两个分子量段蜜蜂巢脾多糖对肺炎链球菌的抑菌性情况如图1所示。

图1 两个分子量段蜜蜂巢脾多糖对肺炎链球菌的抑菌性图

由图1可知，两个分子量段的巢脾多糖对肺炎链球菌均有较好的抑菌活性，且其抑菌活性均呈现浓度依赖性，在多糖浓度为200 mg·mL-1时，两个分子量段的巢脾多糖均对肺炎链球菌呈现最大抑菌活性，在此浓度下HCP-L及HCP-H产生的抑菌圈分别是15.72 mm及14.82 mm。在6个浓度梯度下，HCP-L对肺炎链球菌的抑菌活性均稍强于HCP-H，但是两个分子量的巢脾多糖对肺炎链球菌的抑制作用差异并不明显。

但是这些努力没有来得及挽回另外3个受害者的生命：27岁的玛丽·瑞娜刚刚生完小孩，正在休产假，结果服了有毒胶囊，当场丧生。美国航空公司空乘波拉·普林斯死在芝加哥郊区的家中，身边是泰诺速效胶囊的药瓶。同样惨遭厄运的还有与她同龄的玛丽·迈克菲兰。短短两天，小小的胶囊就夺走了7条人命。

2.1.2 蜜蜂巢脾多糖对枯草芽孢杆菌的抑菌性

由图2可知，两个分子量段的巢脾多糖对枯草芽孢杆菌均有较好的抑菌活性，其抑菌活性均呈现一定浓度依赖性，在多糖浓度为200 mg·mL-1时两个分子量段的巢脾多糖均对枯草芽孢杆菌呈现最大抑菌活性，在此浓度下HCP-L及HCP-H产生的抑菌圈分别是11.79 mm及10.83 mm。在6个浓度梯度下，HCP-L对枯草芽孢杆菌的抑菌活性均稍强于HCP-H，但是总体而言两个分子量的巢脾多糖对肺炎链球菌的抑制作用差异并不显著。

图2 两个分子量段蜜蜂巢脾多糖对枯草芽孢杆菌的抑菌性图

2.1.3 蜜蜂巢脾多糖对大肠杆菌的抑菌性

两个分子量段巢脾多糖对大肠杆菌的抑菌活性检测结果如图3所示，HCP-H对大肠杆菌不具有抑菌活性，而HCP-L则对大肠杆菌均有较好的抑菌活性，其抑菌活性均呈现一定浓度依赖性，在多糖浓度为200 mg·mL-1时对肺炎链球菌呈现最大抑菌活性，在此浓度下产生的抑菌圈是11.24 mm。

图3 两个分子量段蜜蜂巢脾多糖对大肠杆菌的抑菌性图

2.1.4 蜜蜂巢脾糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性

两个分子量段巢脾多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌活性检测结果如图4所示，两个分子量段的巢脾多糖对金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性，其抑菌活性均呈现一定浓度依赖性，在多糖浓度为200 mg·mL-1时两个分子量段的巢脾多糖均对金黄色葡萄球菌呈现最大抑菌活性，在此浓度下HCP-H及HCP-L产生的抑菌圈分别是11.28 mm及13.65 mm。在6个浓度梯度下，HCP-L对金黄色葡萄球菌的抑制作用均强于HCP-H。

图4 两个分子量段蜜蜂巢脾多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性图

研究表明，动植物多糖具有体外直接抑菌活性[6-8]，本研究结果显示，两个分子量段巢脾多糖对肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌均具有较好的体外抑菌活性。抗菌化合物的抗菌机制包括细胞壁的破坏、膜通透性的变化、蛋白质和核酸分子的变化、酶的抑制及核酸合成的抑制等[9-10]。本研究中不同分子量的巢脾多糖对不同的细菌呈现出不同的抑菌活性，低分子量的HCP-L略高于高分子量的HCP-H，说明分子量对巢脾多糖抑菌活性的有一定影响，推测其原因可能是巢脾多糖对细菌的抑制主要是通过破坏细胞壁来作用，高、低分子量的巢脾多糖对细胞壁的破坏作用没有差异或者差异不大，而低分子量的巢脾多糖由于分子量小，更易通过细胞膜进入细胞内，进一步对蛋白质和核酸产生微量作用，因此抑菌作用略高于高分子量巢脾多糖。这一推测还需要进一步研究证实。此外，HCP-H对大肠杆菌不具有抑菌活性，而HCP-L则对大肠杆菌具有较好的抑菌活性，杜恒裔等[7]也发现浒苔多糖对大肠杆菌无抑制活性，其具体原因及机制还需要进一步分析研究。但是两个分子量巢脾多糖的抑菌活性差异并不显著，因此从生产实际出发对其进行分离纯化没有意义。

2.2 两个分子量多糖的体外抗氧化活性比较分析

2.2.1 抑制羟自由基能力测定结果

两个分子量段巢脾多糖抑制羟自由基能力测定结果如图5所示，两个分子量段巢脾多糖均具有较好的抑制羟自由基能力，且与浓度呈现量效关系。多糖浓度在5～20 mg·mL-1时，HCP-L和HCP-H抑制羟自由基的能力随着浓度的升高逐渐增强，且HCP-L的抑制羟自由基能力强于HCP-H；当浓度为20～40 mg·mL-1时，HCP-H抑制羟自由基能力随着浓度的增加迅速增加，超过HCP-L。

图5 两个分子量段巢脾多糖对羟自由基的清除能力图

2.2.2 抗超氧阴离子自由基测定结果

两个分子量段巢脾多糖抗超氧阴离子自由基测定结果如图6所示，两个分子量段巢脾多糖均具有较好的抑制羟自由基能力，且与浓度呈现量效关系。当多糖浓度＜20 mg·mL-1时，两个分子量段的巢脾多糖的抗超氧阴离子能力差异不大；当浓度为20～40 mg·mL-1时，HCP-H的抗超氧阴离子能力呈持续上升趋势且明显强于HCP-L，HCP-L的抗超氧阴离子能力在多糖浓度为40 mg·mL-1达到最高 37.78 U·L-1。

图6 两个分子量巢脾多糖对超氧阴离子的清除能力图

2.2.3 总抗氧化能力测定结果

不同分子量段多糖的总抗氧化能力测定结果如图7所示，两个分子量段巢脾多糖均具有较好的总抗氧化能力，且与浓度呈现量效关系，HCP-H的总抗氧化能力略大于HCP-L。

图7 两个分子量巢脾多糖对总抗氧化能力的测定图

多糖是一类具有多种活性的生物大分子[11-14]，其中研究较多的是抗氧化活性[15-18]，但是对不同分子量多糖活性的研究较少[19-20]。本研究结果显示，两个分子量段的巢脾多糖都具有较好的抗氧化活性，且HCP-H较HCP-L具有较好的抗氧化活性。

3 结论

课题组前期研究结果表明，巢脾多糖具有较好的体外抗氧化活性，为进一步研究其生物活性，以更好地应用于生产实际，本实验利用超滤技术将巢脾多糖分为分子量4～100 kDa（HCP-L）及大于100 kDa（HCP-H）两个级别，首先采用纸片扩散法测定HCP-L和HCP-H对肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌性，并对其体外抗氧化活性进行检测。实验结果表明HCP-L的抑菌活性略高于HCP-H，而HCP-H较HCP-L具有较好的抗氧化活性。

中国是传统养蜂大国，每年淘汰的老巢脾数量可观，而这些老巢脾大都被用来提取蜂蜡，其中水溶性的活性物质如多糖常常被丢弃，本研究结果提示，巢脾多糖可作为天然保鲜剂进行开发，同时若生产以抑菌活性为需求的产品则无需考虑其分子量的影响，而若以抗氧化活性为功效需求，则可选择活性相对较高的HCP-H。