食品中菌落总数能力验证的结果分析与质量控制探讨

◎ 卢福荣，李 杰，邵 悦，高 阳

（1.营口市食品药品检验检测中心，辽宁 营口 115000；2.欧陆食品检测服务（大连）有限公司，辽宁 大连 116023）

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌落的总数。它可以反映食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。在历年国家监督抽检工作中，不合格的微生物指标主要是菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌的污染[1]。菌落总数项目的检测包括多种产品类别，如糕点、饮料、乳制品及肉制品等，长期食用菌落总数超标的食品对人体健康会产生危害[2]。因此，食品中菌落总数的测定具有重要意义，不仅能为深入研究奠定理论基础，同时也为后续实验提供参考。

能力验证是利用实验室间对比，按照预先制定的准则评价参加者的能力[3]，能力验证也是实验室质量管理运行中风险管理和质量持续改进的方式之一[4]。营口市食品药品检验检测中心微生物检验室2020年参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中菌落总数的检测能力验证，对2份待测样品进行了稀释、培养、计数，取得结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 测试样品

样品1：由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，食品中菌落总数的检测能力验证ACAS-PT89（2020），样品编号：20-D980。

样品2：由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，食品中菌落总数的检测能力验证ACAS-PT89（2020），样品编号：20-R172。

1.2 试剂及培养基

氯化钠，批号：20190515，规格：500 g/瓶，国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂，批号：1085235，规格：250 g/瓶，广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器，设备编号：2015-B3316，厂家：上海博讯实业有限公司；生化培养箱，备编号：150093，厂家：上海博讯实业有限公司；生物安全柜，设备编号：HR1500-IIA2，厂家：青岛海尔生物医疗股份有限公司；可调移液器，型号：容量1 mL，容量10 mL；品牌：普兰德公司。

1.4 检验方法

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[5]、能力验证参试指导书进行检测。

1.5 操作步骤

1.5.1 样品前处理

按照参考说明指导，对样品进行处理。将待测试样品从冰箱中取出，恢复至常温，在生物安全柜内将待测试样品1的西林瓶打开，立即加入5 mL无菌生理盐水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，用余下的无菌生理盐水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，定容至60.0 mL，充分混匀，此溶液即是待测样品原液。对样品2处理方法相同。

1.5.2 样品稀释

按照GB 4789.2—2016中“样品的稀释”要求对两份样品分别进行稀释，用无菌吸管吸取25 mL样品匀液注入225 mL 0.85%生理盐水稀释液中，旋涡充分混匀，再吸取1 mL注入9 mL稀释液中，逐级稀释，制成10倍系列稀释的样品匀液，即10-1～10-5。

1.5.3 样品培养

将样品原液和各稀释度样品匀液各取1 mL注入无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基15～20 mL倾注平皿中，并转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后再覆盖一层培养基（约4 mL）。待凝固后，将平板翻转，于（36±1）℃下培养48 h。

1.5.4 计数与报告

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）中的标准要求进行计数和结果报告。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果分析

样品计数结果及结果报告见表1。对样品1选取原液进行结果计算，选取原液、10-1及10-2稀释度，结果为220 CFU·mL-1；样品2选取10-2稀释度进行结果计算，选取 10-2、10-3及10-4稀释度，结果为10 000 CFU·mL-1。

表1 样品测试结果表

菌落计数结果与稀释度倍数成反比，且同一稀释度平行样品间差异较小，表明实验结果相对准确，空白对照无菌落生长，表明实验过程无污染，实验结果有效。

2.2 能力验证结果分析

能力验证结果见表2。能力验证评价标准按照|Z|值进行评价，|Z|＜2.0为满意结果；2.0＜|Z|＜3.0为可疑结果；|Z|≤3.0为不满意（离群）结果。营口市食品药品检验检测中心微生物检验室两组实验结果|Z|值均小于2.0，且|Z|值较小，评价结果满意。因此，营口市食品药品检验检测中心微生物检验室在菌落总数项目上检测具有较好的检测能力。

表2 能力验证评价结果表

2.3 菌落总数检测质量控制分析

本次菌落总数的能力验证严格按照国标方法及操作指导书要求操作，并对实验过程每个可能存在不确定度和风险的环节进行严格控制，如实验备品灭菌情况、无菌操作、样品液制备及稀释、稀释液吸取量、计数方面和温湿度等，所得实验结果较为理想。

2.3.1 实验备品灭菌的控制

PCA培养基、0.85%生理盐水、移液器、枪头等所有实验相关用品应严格按照要求，在121 ℃条件下高压灭菌15 min，确保无菌状态，避免对检验结果产生不良影响。

2.3.2 无菌操作的控制

严格按照无菌操作要求进行实验，开始操作前实验人员应戴好帽子、口罩、手套，防止样品被污染，同时做好个人安全防护。样品内可能含有致病菌，因此本实验应在生物安全柜中进行操作，实验前生物安全柜应紫外灭菌30 min，用75%乙醇擦拭实验台面及操作人员双手，打开样品西林瓶前同样需用75%乙醇擦拭瓶盖，确保实验全过程为无菌操作。

2.3.3 样品液制备的控制

①能力验证的样品为冻干粉装，在样品液的制备过程中，冻干粉应充分溶解。为了增加溶解性，将灭菌好的稀释液（0.85%生理盐水）放入46 ℃恒温水浴锅内保温。②打开样品西林瓶，加入5 mL无菌生理盐水进行再水化时应用移液器反复吹打，使其充分混匀。③为避免气溶胶的产生，应采用带滤芯的枪头，同时控制好吹打力度。④待溶解后，吸出放入无菌瓶中，用余下的无菌生理盐水清洗西林瓶内壁，应多次反复冲洗，确保西林瓶内所有菌液都被收集。⑤定容要准确。

2.3.4 稀释液吸取量的控制

样品稀释液含量会直接影响结果的准确性，应严格按照稀释比例进行样品的稀释。高压灭菌会使稀释液的含量减少，因此，本实验为避免稀释液散失，采用灭菌后实验前定量分装。同时要正确使用移液器，确保吸取量准确。

2.3.5 计数琼脂的控制

实验室购买的PCA琼脂培养基应有相应的质控报告，同一批次的培养基应按照GB 4789.28—2013标准要求进行验收。①培养基温度要控制在46 ℃左右，将配置好的PCA琼脂培养基放置46 ℃恒温水浴锅中保温，避免培养基温度过高或过低影响实验结果。②倾注培养基时应果断迅速，控制在15 min内完成倾注，避免样品稀释液中微生物生长或失活，影响实验结果。③倾注培养基旋转混匀时，应向同一方向旋转5次，然后反方向旋转5次，旋转时应注意防止混合物溅到平皿上方，影响实验结果。④平皿倾注的厚度按要求为9 cm，培养皿应倾注15～20 mL培养基。

为防止培养后菌落蔓延，需在倾注完待琼脂凝固后，加3～4 mL PCA琼脂培养基覆盖平皿表层，便于结果计数。倾注完成的培养基应倒置培养，倒置培养可防止培养水分蒸发时形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌，同时可防止菌落蔓延，有利于单菌落的形成，便于计数。

2.3.6 计数观察控制

有研究表明，PCA直接倾注法菌落生长相对较快，培养24 h，菌落数已达到峰值，因此在培养24 h后应进行一次观察计数，以防止菌落被覆盖而影响到计数结果。

3 结论

本此实验菌落总数测定的结果相对准确，符合检验标准要求及相关的质量要求，能够为菌落总数检测提供科学准确数据，为实验室的持续运行提供了技术支撑，也能更好地为地方食品安全监管作出贡献。

同时，能力验证也是客观的实验室技术能力和管理水平的考核方法，是重要且有效的实验室外部质量控制评估手段[3]。能力验证不仅可以真实的反映出实验室在项目检验中的水平，且可通过能力验证的结果，分析该项目在检验过程中存在的问题，对不满意结果进行“人、机、料、法、环”多方面分析，从而帮助实验室解决可能存在的问题，并及时改进。