HPLC同时测定不同品系桂郁金中吉马酮和呋喃二烯含量

赵应学，王 建，覃乾汉，梁春贤，莫 莹，贺兰芝，杨传强，张 婷，刘喜华

（1.广西壮族自治区江滨医院，广西 南宁 530021；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.广西壮族自治区食品药品监督管理局，广西 南宁 530002；4.广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530021）

桂郁金是广西道地药材之一，为临床常用中药品种，其来源为姜黄属植物广西莪术（Curcuma kwang⁃siensisS.G.Lee et C.F.Liang）的块根，收载于2015年版《中华人民共和国药典》一部，具有活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄功效［1］。现代研究表明，桂郁金主要有效成分为姜黄素类及挥发油类［2］，其中挥发油的主要有效成分为吉马酮、呋喃二烯等倍半萜类化合物［3］，药理研究表明吉马酮与呋喃二烯具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等药理作用［4-5］。近年来，关于桂郁金研究主要集中在化学成分分析、指纹图谱研究、药理作用、种质资源、炮制工艺等方面［6-16］。广西莪术植物可分为两种药材，根茎入药为莪术，块根入药为郁金。目前文献报道多为两种药材各自研究，尚未见从不同品系原植物同时筛选两种药材优良品系的报道。本课题组选择以根茎（莪术）为选育目标，结合植物学性状、药材产量、挥发油含量筛选出8种广西莪术优良品系［17-22］，本研究以其块根（桂郁金）作为研究药材，通过测定桂郁金块根中挥发油及吉马酮、呋喃二烯的含量，对8种优良广西莪术品系的块根（桂郁金）进行质量评价，以期从8种优良品系中筛选出莪术（根茎）、桂郁金（块根）双优的广西莪术植物品系，为进一步申报新品种提供技术支撑，为建立桂郁金质量标准提供依据。

1 实验材料

1.1 药材 不同品系桂郁金是本课题组采用系统选育的方法，自2000年起分别在广西钦州、兴业、灵山、玉林、贵港、桂平、平南、青塘、横县、邕宁和金秀等地收集109份广西莪术种质材料，并建立广西莪术种质资源圃，统一种植在广西南宁市仙葫罗村课题药材基地，以植物学性状、药材性状、单株产量、挥发油含量、吉马酮含量等指标选育，至2018年筛选得到广西莪术（根茎）8个优良品系：C84（兴业）、C16（钦州）、B97（灵山）、玉8/81（玉林）、玉3/B3（玉林）、玉11/28（玉林）、B72（玉林）、C105（钦州）。本实验以筛选出的8个广西莪术优良品系的根茎（桂郁金）为实验材料，经广西中医药大学王建教授鉴定为广西莪术（Curcuma.kwangsiensisS.G.Lee.et.C.F.Liang），试验药材于2018年12月下旬采收后，洗净去泥沙，自然阴干，粉碎成细粉，并过40目筛后备用。不同品系桂郁金药材来源见表1。

表1 不同品系桂郁金药材来源

1.2 试药 吉马酮（纯度为99.8%，批号：111665-201605）购自中国食品药品检定所；呋喃二烯（纯度为99.4%，批号：111824-201102）购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水。

1.3 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪（Agilent Technologies Co.Ltd.）；Sartorius BP2215型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5 ml轻油型挥发油测定器、回流提取装置（广西南宁融仪实验设备有责任公司）；TDL-4型离心机（上海安亭科学仪器厂）；HDM2000型电热套（常州国华电器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取与测定［16］取不同品系桂郁金鲜品适量，切成约3 mm×5 mm大小，称取100 g置于200 0 ml烧瓶中，加蒸馏水800 ml摇匀混合后，加入沸石，参照2015年版《中华人民共和国药典》四部通则挥发油测定法［23］，浸泡约20 min后回流提取并保持微沸约7 h，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置15 min，待静置分层后读取挥发油量体积（ml），记录挥发油颜色，并计算供试品中挥发油的得油率，结果见表2。

表2 不同品系桂郁金挥发油测定结果

2.2 色谱条件 色谱柱：20RBXSB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱条件见表3；检测波长：216 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：10µl。

表3 梯度洗脱条件

2.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称取吉马酮、呋喃二烯对照品适量，置于10 ml容量瓶中，加甲醇制成吉马酮浓度为889µg/ml、呋喃二烯浓度为933µg/ml的溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备 取本品粉末（过4号筛）约2 g，精密称定，置50 ml锥形瓶中，精密加入甲醇10 ml，摇匀，密塞，超声提取30 min，放冷，用甲醇补足重量，作为供试品溶液。

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10µl，按“2.2项”色谱条件进样测定，结果供试品溶液中吉马酮和呋喃二烯两种有效成分分离良好，相邻峰无干扰，见图1、图2。

图1 混合对照品溶液HPLC图谱

图2 C84桂郁金供试品溶液HPLC图谱

2.5 线性关系考察 将“2.3项”下制备的混合对照品贮备液由高至低逐级稀释，制备得系列质量浓度的混合对照品溶液：吉马酮浓度依次为34µg/ml、43.5µg/ml、68µg/ml、85µg/ml、127.5µg/ml、170µg/ml，呋喃二烯浓度依次为40µg/ml、50µg/ml、80µg/ml、100µg/ml、150µg/ml、200µg/ml。精密吸取混合对照品溶液10µl，注入液相色谱仪，按“2.2项”下色谱条件测定，分别记录吉马酮、呋喃二烯的峰面积，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图3、图4。并计算出吉马酮及呋喃二烯的回归方程，结果见表4。

图3 吉马酮标准曲线

图4 呋喃二烯标准曲线

表4 吉马酮与呋喃二烯回归方程及线性范围

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10µl，按“2.2项”色谱条件连续进样6次，以校正因子计算出吉马酮RSD=0.92%（n=6），呋喃二烯RSD=1.15%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 定量限检测 取吉马酮对照品溶液（浓度为2.055µg/ml）10µl注入高效液相色谱仪，计算出信噪比为2.40；取呋喃二烯对照品溶液（浓度为0.993 7µg/ml）10µl注入高效液相色谱仪，计算出信噪比为8.20。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的C105样品6份，每份各约2 g，置于50 ml塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液（吉马酮浓度为1.392 mg/ml、呋喃二烯浓度为1.571 mg/ml）0.75 ml、0.75 ml、0.50 ml、0.50 ml、0.25 ml、0.25 ml，精密加入甲醇使总体积为10 ml，余下操作同“2.4项”，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表5、表6。

表5 吉马酮加样回收率试验结果 （n=6）

表6 呋喃二烯加样回收率试验结果 （n=6）

2.9 样品测定 取8个样品按“2.4项”方法制备成供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10µl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算吉马酮、呋喃二烯的含量。结果见表7。

表7 吉马酮、呋喃二烯含量测定结果（n=8）

3 讨论

3.1 不同品系桂郁金挥发油含量比较 不同品系桂郁金挥发油含量在0.07%~0.21%之间，挥发油含量平均值为（0.13±0.04）%，RSD为3.96%。其中提取得到挥发油含量较高的是玉8/81，达到0.21%；较低的为C84，挥发油含量仅为0.07%，可见不同品系广西莪术挥发油含量存在较大差异。

3.2 不同品系桂郁金吉马酮、呋喃二烯含量比较 不同品系桂郁金中吉马酮的含量在0.364 2～1.055 6 mg/g之间，其中吉马酮含量最高为C84，达到1.055 6 mg/g；含量最低为C105，含量为0.364 2 mg/g；平均值为（0.634 2±0.220 8）mg/g，RSD为23.61%。呋喃二烯的含量在0.417 3～1.168 7 mg/g之间，其中呋喃二烯含量最高为C84，达到1.168 7 mg/g；含量最低是C105，含量为0.417 3 mg/g；平均值为（0.744 7±0.258 4）mg/g，RSD为27.63%。可见不同品系桂郁金吉马酮、呋喃二烯含量差异较大。两者含量由高到低排序均为C84>C16>B97>玉8/81>玉3/B3>玉11/28>B72>C105，表明同一品系吉马酮含量较高者其呋喃二烯含量也较高，反之，吉马酮含量较低者其呋喃二烯含量也较低。

3.3 小结 本研究通过测定挥发油及吉马酮、呋喃二烯含量，以评价8种优良广西莪术品系块根桂郁金的质量，同时也建立桂郁金中呋喃二烯的含量测定方法，结果表明双优品系以C84和C16质量为优，该成果将进一步申请新品种在道地产区进行推广，同时也为桂郁金新品选育及建立桂郁金质量标准提供参考依据。由于本研究所选的8个不同品系桂郁金是在种植管理条件一致情况下，经过多年不断种植选育形成的稳定品系，因此实验药材在挥发油、吉马酮和呋喃二烯含量所表现出的差异，实则为桂郁金的种内差异，此差异由基因决定，要揭示差异的真正原因，还应进行进一步的分子标记研究，如SSR（simple sequence re‐peat）或ISSR（inter-simple sequence repeat）。另外，吉马酮与呋喃二烯均为广西莪术植物在生长过程中形成的次生代谢产物，二者均为倍半萜类化合物，可见同一品系桂郁金中吉马酮与呋喃二烯存在一定相关性，这种相关性是否与基因组有关，还有待进一步研究。