油茶叶多糖的闪式提取工艺优化及其抗氧化活性

叶 润， 蔡 静， 李尽哲， 孙 伟， 申家朋

(1.信阳农林学院 生物与制药工程学院,河南 信阳 464000； 2.信阳农林学院 林学院, 河南 信阳 464000)

油茶(CamelliaoleiferaAble.)，别名茶油树、茶子树等，属茶科，常绿小乔木，主要分布于我国的云南、广西、浙江、河南、安徽等地[1-2]。油茶是我国主要的油料作物之一，享有“东方橄榄油”的美誉，其果实榨出的油，脂肪酸含量低，多酚含量高，对人体有益处[3-4]。近年来有很多文献对油茶籽及壳的化学成分及药理活性进行了报道，但是对油茶叶的研究文献较少。本研究在单因素试验基础上采用响应面法对油茶叶多糖的闪式提取工艺进行优化，并对得到的油茶叶多糖的体外抗氧化活性进行测试，以期提高油茶的应用价值，为油茶资源的合理开发利用提供科学支持。

1 实 验

1.1 原料、试剂及仪器

油茶叶，2020年3月份采于信阳市光山县槐店乡油茶基地，树龄8年，为普通油茶品种，经信阳农林学院中药制剂教研室梁丽香副教授鉴定，油茶叶经干燥处理，粉碎至0.300 mm，备用；葡萄糖对照品，购自中国药品生物制品检定所；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、ABTS的二铵盐、抗坏血酸(VC)，均为分析纯，购于上海晶抗生物工程有限公司；无水乙醇、双氧水、苯酚、水杨酸、过硫酸钾、硫酸亚铁，均为分析纯，购于上海中石化三井化工有限公司。

FA2204B电子分析天平，上海精科天美公司；JHBE-60T闪式提取器，上海钒帜精密设备有限公司；RE-85Z旋转蒸发仪，巩义市英峪予华仪器；UV-2600紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1油茶叶多糖的闪式提取 参考文献[5～6]操作，称取20 g油茶叶粉末，置于闪式提取器中，按一定的料液比加入蒸馏水，在一定温度下提取一定时间。提取结束后，过滤，取上清液，加入90%的乙醇使油茶叶多糖沉淀，离心过滤后取固相进行干燥，即得油茶叶粗多糖。

依据参考文献[7]，采用苯酚-硫酸法测定多糖质量浓度，并计算多糖得率。

式中：Y—多糖得率，%;c—粗多糖溶液质量浓度，g/L；V—粗多糖溶液的体积，mL；m—原料的质量，g。

提取过程中分别考察了料液比(1 ∶10～1 ∶60，g ∶mL)、提取温度(40～90 ℃)以及提取时间(10～110 s)这3个因素对多糖得率的影响。

1.2.2提取工艺的响应面优化 在单因素试验基础上，借用Desgin-Expert 10.0.4软件，以料液比、提取时间、温度为因素，以多糖得率为响应值设计3因素3水平的响应面试验，对油茶叶多糖的提取工艺条件进行优化[8-10]。

1.3 油茶叶多糖的抗氧化活性测定

1.3.1DPPH·清除能力 参考文献[11～12]，在100 mL容量瓶中用无水乙醇配制0.5 mmoL/L的DPPH-乙醇溶液，放冰箱中保存待用。分别配制油茶叶粗多糖质量浓度为0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0 g/L，各取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液，向其中加入1.0 mL不同质量浓度的多糖溶液，室温下静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度。用乙醇代替DPPH作为对照组测定吸光度，用蒸馏水代替多糖作为空白组测定吸光度。用相同质量浓度的VC溶液按照上述方法进行测定，作为阳性对照。

1.3.2·ABTS+清除能力 首先制备·ABTS+工作液：将浓度为7.5 mmoL/L的ABTS二铵盐溶液和2.5 mmol/L 的过硫酸钾溶液等体积混合，避光保存，反应15 h，即生成·ABTS+，使用前，用无水乙醇将自由基储备液进行稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.1。参考文献[13]，各取2 mL的·ABTS+工作液，再向其中分别加入0.5 mL不同质量浓度(0.5～4.0 g/L)的多糖溶液，避光条件下反应10 min，在734 nm波长测定吸光度。用蒸馏水代替·ABTS+工作液作为对照组，用蒸馏水代替多糖溶液作为空白组。用相同质量浓度的VC溶液作为阳性对照。

1.3.3OH·清除能力 采用Fenton体系法，分别取2.0 mL不同质量浓度的多糖溶液，向其中加入1.0 mL 5.0 mmol/L的水杨酸溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的硫酸亚铁溶液，摇匀后，加入1 mL 5.0 mmoL/L的H2O2和2 mL的蒸馏水，置于30 ℃水浴锅中反应0.5 h，在510 nm处测定吸光度。用蒸馏水作为对照样和空白样。用相同质量浓度的VC溶液作为阳性对照[14]。

DPPH·、·ABTS+、OH·清除率(η)计算公式如下：

式中：A空白—在测定波长处空白组的吸光度值；A样品—在测定波长处样品的吸光度值；A对照—在测定波长处对照组的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

不同提取条件对油茶叶多糖得率的影响见图1。由图1(a)可知，当料液比为1 ∶30(g ∶mL)时，油茶叶多糖的得率最大，这主要是因为溶剂太少不利于多糖的接触溶解；溶剂太多，闪式提取器中的搅拌器的阻力增大。由图1(b)可知，当温度为80 ℃时多糖得率最大，这是因为温度太低，多糖的溶解速率低；温度过高，会导致多糖的分解或氧化。由图1(c)可知，提取时间为70 s时多糖得率最大，这主要是因为时间过久，会导致多糖部分结构被破坏。由此可见，单因素试验得到闪式提取较佳条件为：料液比1 ∶30(g ∶mL)，温度80 ℃，提取时间70 s。

a.液料比 liquid-material ratio； b.提取温度 extraction temperature； c.提取时间 extraction time

2.2 响应面法试验结果与分析

2.2.1响应面法试验结果 在单因素试验结果的基础上，以料液比、提取温度和提取时间为3个影响因素，以多糖得率为响应值设计的响应面试验结果见表1。

表1 响应面试验结果

利用Desgin-Expert 8.0.6软件分析，得三元二次回归方程：Y=8.16+0.026A+0.096B+0.15C+0.020AB-2.5×10-3AC-0.028BC-0.16A2-0.21B2-0.21C2。

2.2.2方差分析 响应面方差分析结果见表2。由表2可知，一次项中温度和提取时间的影响为极显著，料液比的影响为显著；二次项中A2、B2、C2的影响为极显著，该模型的P<0.001，表明该模型具有较好的预测性；决定系数R2为0.992 0，表明该模型与实际试验拟合较好。校正后的决定系数R2为0.981 7，与R2接近，说明模型有较好的准确性和通用性。由F值可知，各因素对油茶叶多糖提取的影响顺序为：提取时间(C)>提取温度(B)>料液化(A)。

表2 响应面方差分析

2.2.3两因素相互影响的响应曲面分析 两因素相互影响的结果见图2。由图2(a)可知，当料液比一定时，多糖得率随着温度的升高先增加后降低，当提取温度为80～82 ℃，达到最大值。当温度一定时，多糖得率随料液比的增加先增加后降低，当料液比在1 ∶30～1 ∶31(g ∶mL)时达到最大值。由图2(b)和图2(c)可以看出，多糖得率随着提取时间和料液比的增加先增大后减小，多糖得率随着提取时间与提取温度的增加亦呈现先增大后减小的趋势。

a.Y=f(A，B)； b.Y=f(A，C)； c.Y=f(B，C)

响应面3D图中曲面越陡峭，说明两因素的交互作用对油茶叶多糖提取得率的影响越显著。由图可知，BC的曲面最为陡峭，即在油茶叶闪式提取多糖工艺中，温度与提取时间的交互作用对提取效果的影响最为显著。各因素交互影响的顺序为：BC>AB>AC。

用Desgin-Expert 10.0.4软件对结果进行分析，预测油茶叶多糖的最佳提取工艺为：料液比1 ∶30.89(g ∶mL)，提取温度81.46 ℃，提取时间73.41 s，预测得率为8.07%。考虑实际可行性，调整为料液比1 ∶30(g ∶mL)，提取温度81 ℃，提取时间75 s，在此条件下，进行3次平行试验验证，油茶叶多糖得率分别为8.35%、 8.44%、 8.50%，平均得率为8.43%，与预测值相近，表明模型具有很好的预测性。

2.3 油茶叶粗多糖的抗氧化性

对提取的油茶叶粗多糖进行抗氧化活性测试，结果如图3所示。由图可见油茶叶粗多糖对DPPH·的清除能力与多糖浓度有一定的量效关系，随着多糖浓度的增大，清除率增大，IC50值为1.706 g/L。当多糖质量浓度为2.5 g/L时，DPPH·清除率大于80%，清除能力显著，与VC相近。

a.DPPH·； b.·ABTS+； c.·OH

在低浓度下，油茶叶粗多糖对·ABTS+的清除率与深度呈现一定的量效关系，随着油茶叶粗多糖浓度的增加，对·ABTS+的清除能力也逐渐增加，当多糖质量浓度为1.5 g/L时，清除能力达到72.35%，IC50值为0.826 g/L，粗多糖同浓度下清除能力略低于VC，表现出很强的清除能力。

油茶叶粗多糖对·OH的清除能力也随着浓度的增大而增强，IC50值为4.811 g/L，当多糖质量浓度为5.0 g/L时，清除率达到58.35%，虽然清除率低于VC，但仍表现出很强的清除能力[15]。

3 结 论

3.1以油茶叶为原料，蒸馏水为溶剂，在单因素试验基础上以料液比、温度、提取时间为因素，以油茶叶多糖得率为响应值，借助Desgin-Expert 10.0.4软件设计3因素3水平试验，对油茶叶多糖闪式提取工艺进行优化，结果表明：较佳工艺为料液比1 ∶30(g ∶mL)，提取温度81 ℃，提取时间75 s，此条件下油茶叶多糖得率为8.43%。

3.2较优条件下提取的油茶叶粗多糖对DPPH·、·ABTS+、OH·都有很好的清除能力，IC50值分别为1.706、 0.826和4.811 g/L，虽然略小于VC的清除能力，但仍表现出很强的体外抗氧化活性。