芜菁实时荧光定量PCR内参基因筛选

任延靖，韩 睿，赵孟良*

(1.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；2.青海大学 三江源国家农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

芜菁(BrassicarapaL.ssp.rapa)，又称元根、园根、盘菜[1]。起源于欧洲，即是传统的栽培植物，也是青海高原特色的药材、蔬菜及饲料兼用的块根类作物。在其药用价值方面，近代药理研究发现，其具有预防癌症、抗衰老等功效[2]。在《名医别录》中记载：味苦温，无毒。古代中医书籍上综述，助消化，祛风，镇咳，驱腹胸寒气，解热毒，消肿，强身[3]；《维吾尔药志》记：性温，开胸顺气，健胃消食，解毒；用于胸闷腹胃胀痛，食欲不振，疮疖肿毒等疾[4]。现代医药研究表明：芜菁内含硫化葡萄糖苷物质，水解后可产生芥子油，具有增进食欲，促进肠胃蠕动，帮助消化等作用[5]。近几年来，人们已经逐渐把对芜菁的研究侧重点放在了作为药材的领域[6]，更多的关注其植株体内在的化学成分，如挥发油、脂肪酸、硫苷等代谢机理及调控基因通路方面的研究。

基因表达分析作为揭示植物生命周期中基因功能和调控机制的重要手段之一。因此确保相关基因表达分析的准确性十分重要[7]。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术作为一种常用的检测基因表达量的方法，具有定量准确、可重复性、高灵敏度等优点[8]，广泛应用于基因检测、科学研究、药物研发与疾病诊断等领域[9-10]。选用表达水平不随发育阶段、组织类型等而显著变化的内参基因进行qPCR可以确保结果分析的准确性[11]。因此，在使用qPCR技术对基因表达进行检测分析之前，应筛选合适的内参基因。目前有关芜菁不同组织适宜内参基因筛选的研究未见报道。

本研究以青海本地芜菁品种‘黄金蔓菁’营养生长时期的根肉、叶片、叶柄及生殖生长时期的花蕾、花、茎生叶、花茎和种子为实验材料，利用qRT-PCR技术检测了肌动蛋白基因(β-actin，ACT)，亲环蛋白基因(cyclophilin，CyP)，微管蛋白-a(Tub-a)，双喹酮结合酶30(biquitin-conjugating enzyme30，UBC30)，转录延伸因子(elongation factor 1-alpha，EF-1-α)，双喹酮结合酶21(biquitin-conjugating enzyme21，UBC21)，锌指蛋白(zinc finger protein，ZNF)，TIP41蛋白(TIP41-like protein，TIP41)，三磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，18S核糖体RNA基因(18SrRNA，18S)共10个内参基因的表达情况，并采用geNorm[12]、NormFinder[13]、BestKeeper[14]和RefFinder[15]4种软件对各候选内参基因表达稳定性进行分析，以期准确筛选出芜菁不同组织基因表达分析最适宜的内参基因，为芜菁基因组织表达分析奠定基础。

1 材料

1.1 样品

试验所用材料为青海当地芜菁品种“黄金蔓菁”，2019年1月育苗，3月定植于温室内，8月营养生长时期随机取5株的根肉、叶片、叶柄及2020年4月种株留种至生殖生长时期的花蕾、花、茎生叶、花茎和种子，用灭菌后的小刀切成小块后装于2ml无酶管，置于液氮中速冻，储存于-80℃保存，每个样品重复3次。

1.2 试剂与仪器

总RNA提取试剂盒，DL2 000 DNA Marker，PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Kit cDNA合成试剂盒(TaKaRa)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，TaKaRa)，Eppendorf PCR仪(德国)，Eppendorf 离心机(德国)，超低温冰箱，NanoDrop2000核酸检测仪。

2 方法

2.1 总RNA提取与cDNA合成

按照植物总RNA提取试剂盒操作提取总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用NanoDrop2000检测仪测定其浓度和纯度，A260/A280在1.9-2.0之间，RNA的总体质量较好。采用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，将cDNA置于-20℃保存备用。

2.2 候选内参基因的引物设计及验证

在ICG(http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page)中以十字花科作物为参照选择10个候选内参基因，使用Primer Premier 5设计特异引物。内参基因的特异引物见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在实时荧光定量中，通过溶解曲线判断引物的特异性，若溶解曲线为单峰说明引物特异性好。

表1 qRT-PCR中内参基因的引物序列Table.1 Primer sequence of internal reference gene in qRT-PCR

2.3 内参基因的实时荧光定量PCR

荧光定量PCR参照LightCycler/LightCycler 480 System的操作方法。在冰上配置反应体系为20ul，包含10ul TB Green Premix Ex Taq II(Ti RNaseH Plus)，上、下游引物各0.8ul，2ul cDNA，ddH2O 6.4ul。qRT-PCR反应程序依次为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，40个循环。最后溶解曲线分析：95℃ 5s，65℃ 60s，95℃ 5s。

2.4 数据处理与分析

通过qRT-PCR对参试样品的cDNA进行检测，使用LightCycle®480II PCR定量分析仪自带软件进行数据分析，得到各样品的Ct，将数据导入geNorm，NormFinder，BestKeeper中并通过Delta CT法分析各内参基因的稳定性，同时利用RefFinder对各内参基因的稳定性进行综合评价，筛选出芜菁不同组织中基因表达分析的最适内参基因。

3 结果与分析

3.1 内参基因引物特异性及扩增效率分析

以不同部位的cDNA为模板，对10个候选内参基因进行qRT-PCR，制作标准曲线(图1)，其中18SrRNA和GAPDH无结果，舍弃。如表2所示，对剩下的8个参考基因的qRT-PCR的扩增效率(E)进行了分析，结果发现从ACT和CyP的98.9%到EF-1-a的99.3%不等，相关系数(r)范围从Tub-a的0.836到ACT和CyP的0.972。溶解曲线分析结果还表明8个引物扩增产物对应于单个片段，均只有明显的单一峰值，无发夹结构和引物二聚体等非特异性扩增(图1)，进一步说明引物特异性好。

表2 qRT-PCR分析中8个内参基因特异性引物参数Table.2 Specific primer parameters of 8 internal reference genes in RT-PCR analysis

图1 芜菁候选内参基因的qRT-PCR溶解曲线Fig.1 Melting curves of candidate internal reference genes for qRT-PCR analysis in Brassica rapa L.ssp.rapa

3.2 内参基因的表达谱分析

对各样品中8个候选内参基因的表达水平(Ct)进行了分析，其中Ct越小表明该基因表达水平越高，且同一候选基因在不同部位中的Ct的变化反应了该基因的稳定性，变化越小表明该基因越稳定。各候选内参基因在不同样品中的平均Ct介于21.61-27.31，其中以CyP平均Ct最小，为21.61，表明其表达水平最高，ZNF的平均Ct最高，为27.31，表明其在各个样品中表达水平最低。按照Ct值的大小可以看出8个候选内参基因的表达由高到低依次为CyP、UBC30、ACT、EF-1-a、UBC21、Tub-a、TIP41、ZNF。此外，TIP41基因的Ct变化范围最小为9.03，其次是UBC30，ΔCt为9.91，变化范围最大的EF-1-a和ZNF，ΔCt为35，由于此值超出了荧光定量分析的最大临界值，故EF-1-a和ZNF不适合作为芜菁的内参基因，舍弃。

3.3 不同组织内内参基因的稳定性分析

3.3.1 geNorm分析

利用geNorm程序对各剩下的6个内参基因表达稳定性进行了分析，通过计算基因的表达稳定值(M)，对基因的表达稳定性进行排序，M越小，表明基因的稳定性越高。结果表明，芜菁不同部位中内参基因表达稳定由高到低依次为UBC21/TIP41>UBC30>ACT>Tub-a>CyP，即UBC21和TIP41的表达最为稳定，CyP的稳定性最差(图2)。

图2 geNorm 分析内参基因表达稳定性Fig.2 Analysis of expression stability of internal reference genes by geNorm

3.3.2 NormFinder分析

通过NormFinder程序分析这6个候选内参基因的表达稳定性，稳定值越小的基因的表达越稳定。稳定性排序为TIP41>ACT>Tub-a>UBC30>UBC21>CyP，根据NormFinder的分析结果，TIP41为最优内参基因，与geNorm分析结果一致。

3.3.3 BestKeeper分析

BestKeeper是一种基于原始的Ct值来评价内参基因稳定性的软件。通过BestKeeper软件得到2个指标标准差(SD)、变异系数(CV)，SD和CV值越小，内参基因越稳定。由分析结果可知(表3)，6个候选基因中SD值最小的是TIP41(0.82)，其次是UBC21(0.96)；CV值最小的是TIP41(0.03)，其次是UBC21(0.04)。SD值低于1.0被认为表达稳定。对于ACT、CyP、UBC30及Tub-a的SD值均高于1.0，所以表达不稳定，排除，而UBC21和TIP41的SD值均低于1.0，且TIP41的SD值低于UBC21的，故TIP41最稳定，这也与前两种分析方法得到的结果一致。

3.3.4 RefFinder分析

RefFinder可以综合geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种算法，列出6个候选基因的表达稳定性排名。对所有样品进行分析，稳定性排名前两位的内参基因分别为TIP41和UBC21。

4 讨论与结论

芜菁作为药、食、饲三用的高原蔬菜作物，具有极高的研究价值，尤其在药用价值方面，目前针对芜菁药用价值的研究主要集中在化学成分[16]，海仁古丽·麦麦提等人[17]的研究还表明芜菁还富含中药多糖，有助于降低血糖的作用[18]。芜菁作为一种中药材具有极大的发展前景，今后对其活性成分的提取将成为热点，然而按照传统从原料药中提取活性成分的方法受到供试材料的药用成分活性低等因素的限制很难满足市场需求[19]。因此，利用现代生物技术手段来研究植物体内有效成分合成代谢的遗传基础和分子调控机制，探究具有药用价值的植物体内活性成分的生物合成途径已日渐成为了今后满足人们对活性成分需求的最重要的有效途径之一。芜菁植株体内富含多种活性物质，如黄酮[20-21]、皂苷[22]、挥发油[23]等，未来可被广泛应用于保健品、药品等领域。然而，对其大部分活性成分合成途径的分子基础和遗传调控机制仍不清楚，生物合成途径中涉及的关键酶基因功能也有待进一步的研究。qPCR作为生物领域中分析基因表达的常用技术之一，被广泛的应用在植物次生代谢产物的分子机制研究等领域[24-25]。为了确保目的基因表达分析结果的可靠性和准确性，在qPCR数据处理过程中需要引入合适的内参基因以校正不同样品间由于RNA的提取效率、质量以及反转录效率的不同而导致的误差[26]。据报道，在一些植物中也已开展了相关内参基因筛选的研究，在钝裂银莲花不同部位中以UBQ表现最稳定，而β-TUB相对稳定性最差[27]；在肉桂和大叶清化桂两种植物的皮、枝、叶不同部位最适的内参基因为GAPDH[28]；西红花qRT-PCR分析的合适内参基因为GAPDH和UBQ，可用于种球发育、花发育、次生代谢产物形成和积累等机理研究[29]；在药用植物老鸦瓣中，UBC和UBI均适合作为其不同器官和芽茎不同发育时期基因表达研究的内参基因[30]；梁晴等[31]人对中药材植物川续断植物的内参基因进行了研究，结果表明DaACT103和DaTUB5均可作为川续断的内参基因。以上研究说明了不同植物不同部位及不同的发育阶段下，基因表达分析的最适内参基因的表达不同，这也进一步证明筛选内参基因的重要性。

本试验通过geNorm，NormFinder，BestKeeper法分析得出的最稳定的芜菁内参基因结果一致，以TIP41基因表达最为稳定，其次为UBC21。RelFinder综合了以上3种分析结果，同样综合得出以TIP41基因最为稳定。因此，TIP41可作为研究芜菁不同组织基因表达的理想内参基因。