青海野决明中总生物碱的提取工艺研究

王 欢，刘明珠，芦永昌*

(1.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；3.青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007；4.青海省现代藏药创制工程技术研究中心，青海 西宁 810007)

野决明学名披针叶黄华(Thermopsislanceolata)是我国西部地区早春的重要野生蜜源植物，也是一种重要的固沙植物[1-3]。披针叶黄华属豆科野决明属，主要分布在中国西北地区，20世纪60年代前苏联人对其生物碱研究较多，金雀花碱类是指分子内具有α-吡啶酮环的三环或四环结构的喹诺里西啶类生物碱化合物，野生植物披针叶黄华的种子及全草中含有大量此类生物碱，其极强的生物活性从上世纪70年代起就引起了人们关注[4-7]。临床用金雀花碱0.15%水溶液供肌肉或静脉注射，抢救因手术和各种创伤引起的反射性呼吸暂停、休克和新生儿窒息等。近期研究表明该类生物碱还具有抗心率失常、抗微生物感染、抗溃疡、升高白细胞等多方面的药理作用，特别是该类化合物较强的抗癌活性[8]。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、药材

HX501T电子天平(浙江省慈溪市天东衡器厂)；RE-6000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水多用真空泵(上海予英仪器有限公司)；TU-1800紫外分光光度计(日本岛津公司)。

金雀花碱对照品(上海原叶生物有限责任公司)；乙醇为分析纯；水为超纯水。

2020年7月，野决明采于青海省互助北山，经青海民族大学芦永昌教授鉴定为披针叶黄华(Thermopsislanceolata)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备

精密称取金雀花碱对照品，以氯仿溶解，配制成含金雀花碱0.2mg/ml的对照品溶液，分别取0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml的对照品溶液于25ml量瓶中，用氯仿定容，在最大吸收波长315nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，金雀花碱浓度(μg·ml-1)为横坐标，得到一条通过原点的标准曲线。回归方程为：Y=0.0359X+0.1063(r=0.9998)。金雀花碱在2.4-20μg·ml-1范围内呈良好的线性关系，结果见图1。

图1 标准曲线Figure.1 Standard curve

1.2.2 溶液的制备

精密称取金雀花碱对照品，以氯仿溶解，配制成含金雀花碱0.2mg·ml-1的对照品溶液。将野决明全草晒干，粉碎，过40目筛后，精密称取10g，加85%乙醇热回流提取，得到的滤液减压浓缩，加2mol·ml-1HCl调pH=3，用等量氯仿连续萃取4次，去除色素和脂溶性杂质，得到的酸水层以10%NaOH调pH=10～11，用等量氯仿连续萃取6次，合并氯仿层，浓缩定容至50ml量瓶中，吸取0.1ml此溶液再用氯仿定容至25ml，作为供试品溶液。

1.2.3 含量的测定

准确称取10g披针叶黄华全草，按“1.2.2”项下方法制得到不同样品溶液。在315nm处测定吸光度，根据标准曲线得到野决明中总生物碱的含量。

1.3 单因素试验

野决明风干至恒重，粉碎，过40筛，精确称取10g干粉，按不同乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数进行加热回流提取，过滤，定容，得样品溶液，按照“1.2.3”项下测定吸光度，以标准曲线法计算野决明中总生物碱含量，分别确定最适乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数[9]。

1.4 正交试验及优选

在野决明总生物碱提取单因素试验基础上，对影响总生物碱提取的主要因素(乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数)进行L9(34)正交试验，确定野决明总生物碱提取最佳条件，野决明经粉碎后按比例称取9份，每份10g，加入不同体积分数的乙醇，加热回流提取，过滤，定容，即得1～9号样品溶液，测定金雀花碱含量[10]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度数对总生物碱提取率的影响

在其他条件相同的情况下，分别在315nm处测定温度为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃时的吸光度值，测定结果带入标准曲线所得总生物碱含量如图2所示。由试验结果可知，提取温度为70℃时，野决明中总生物碱的提取率最大达到12.32mg/g，当温度高于或者低于70℃时，提取率都不理想。因此，以下实验中所采用的提取温度为70℃。

图2 提取温度对总生物碱提取率的影响Figure.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total alkaloids

2.1.2 乙醇体积分数对金雀花碱提取的影响

在其他条件相同的情况下，分别在315nm处测定乙醇：水体积比分别为50%、60%、70%、80%、90%时的吸光度值，测定结果带入标准曲线所得总生物碱含量如图3所示。由图3研究结果可知，当乙醇体积分数为60%时，野决明中总生物碱的提取率最大为12.33mg/g，当乙醇体积继续增大时，提取率稍微有所下降，可能是总生物碱的在乙醇中的溶解度达到上限。因此，以下实验中所使用的乙醇体积为60%。

图3 乙醇体积分数对总生物碱提取率的影响Figure.3 Effect of ethanol volume fraction on the extraction yield of total alkaloids

2.1.3 料液比对金雀花碱提取的影响

在其他条件相同的情况下，分别在315nm处测定不同料液比1g∶5ml、1g∶10ml、1g∶15ml、1g∶20ml、1g∶25ml的吸光度值，测定结果带入标准曲线所得总生物碱含量如图4所示。研究结果表明，当料液比为1g∶10ml时，野决明中总生物碱的提取率最高，为12.41mg/g，说明一定量的溶剂可将有效成分完全溶出，再增加乙醇量，提取效果变化不明显。因此，为节省原料，以下试验料液比均采用1g∶10ml。

图4 料液比对总生物碱提取率的影响Figure.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total alkaloids

2.1.4 提取时间对金雀花碱提取的影响

在以上最优试验条件下，分别在315nm处测定处测定回流0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h的吸光度值，测定结果带入标准曲线所得总生物碱含量如图5所示。研究结果表明，随着回流时间的延长总生物碱的提取率也在提高，当提取时间超过1.5h(12.52mg/g)后，总生物碱的提取量增加缓慢，为实现高效提取，最佳的提取时间选择1.5h。

图5 提取时间对总生物碱提取率的影响Figure.5 Influence of extraction times on the extraction yield of total alkaloids

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，以料液比(A)、温度(B)、乙醇体积分数(C)和提取时间(D)为指标，进一步研究各因素对野决明中总生物碱提取的影响，采用L9(34)4因素3水平正交试验，确定总生物碱提取的最佳工艺，各因素水平见表1，由极差分析(表2)可知，各因素作用主次分别为D>A>C>B，说明提取试验的料液比是影响野决明中总生物碱提取的最重要变异因素，最佳提取工艺为A3B2C2D2，即乙醇体积分数70%、料液比1g∶15ml、提取时间1.5h、提取温度为70℃。各因素方差分析(表3、表4)。

表1 乙醇提取工艺正交试验因素水平Table.1 Orthogonal experimental factors of ethanol extraction process

表2 乙醇提取野决明中中金雀花碱正交试验结果Table.2 Orthogonal test results of cytisine type alkaloids in ethanol extraction from Thermopsis lanceolate

表3 金雀花碱方差分析表Table.3 Analysis of variance of cytisine type alkaloids

2.3 精密度试验

取“1.2.1”项下对照品溶液1.0ml，用氯仿定容至10ml量瓶中，按“1.2.3”项下条件重复测定5次，吸光度的RSD=2.68%(n=5)。

2.4 重复性试验

准确称取10g野决明细粉5份，按“1.2.2”项下方法制得到5份溶液，测定吸光度值，RSD=2.15%(n=5)。

2.5 加样回收试验

准确称取10g野决明细粉5份，分别精密加入0.2mg/ml对照品溶液4.0ml按“1.2.2”项下方法制得5份样品溶液。分别在紫外条件下进行检测，测得总生物碱的平均加样回收率为98.6%，RSD=0.217%(n=5)。

2.6 验证试验

为了验证最佳工艺的准确性，保证醇提工艺的合理和稳定，按确定的提取工艺进行平行3次验证试验，野决明中总生物碱含量平均值为12.63mg/g，表明该提取工艺稳定可行。

3 结论

本试验通过单因素试验和正交试验优选出野决明中总生物碱的最优工艺A3B2C2D2即醇体积分数70%、料液比1g∶15ml、提取时间1.5h、提取温度为70℃，验证试验证明结果具有较好的重复性和精密度。