非小细胞肺癌放疗前后Th17的变化与临床意义

吴旭，左扬松，濮娟，潘艳，祝丽晶，侯盼飞

（南京医科大学康达学院附属涟水人民医院，江苏 涟水 223400）

0 引言

肺癌的发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤之首，据世界卫生组织预测，到2025年，我国肺癌患者总数将超过100万，成为世界第一肺癌大国[1]。放射治疗是治疗肺癌的有效手段之一，然而机体的免疫环境复杂，且在肿瘤发生、发展的各个阶段受到多种因素的影响，了解放疗对肺癌免疫细胞的影响对指导肺癌治疗的意义重大。本研究通过流式细胞术（flowcytometry, FCM）测定非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）外周血中辅助性T细胞17(T helper cells 17, Th17)占CD4+T 细胞百分比，统计分析放疗过程中Th17的变化，为肺癌放疗联合免疫治疗提供新的干预靶点，为肺癌患者提供更精准的个体化治疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2019年8月收治于我院的20例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）作为研究对象，年龄60-80（70.41±6.85）岁。纳入标准：①病理证实NSCLC；②首次确诊；③开始采集标本后1月内只接受单纯放疗的患者。排除标准：①处于慢性疾病的急性加重期；②合并自身免疫系统疾病以及应用免疫抑制剂等药物。选取我院职工查体健康者30例作为对照组，年龄60-80（68.51±7.39）岁。两组在性别和年龄方面差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 血样采集

肺癌组分别于放疗前、放疗期间（每隔6次放疗）清晨空腹抽取外周静脉血2mL（肝素抗凝），对照组采集空腹静脉血2mL（肝素抗凝）。

1.3 放疗方法

运用直线加速器（Varian 23-Ex，美国）对入选患者均采用6MV X 线 IMRT 外照射，常规分割 2.0Gy/f，总剂量 DT 60Gy/30f。

1.4 检测方法

按照试剂盒说明书(Becton, Dickinson and Company，美国)处理标本。分别取肝素抗凝血100μL加入已标记好的流式管，用RPMI 16401：1 等体积稀释, 加入2μLBD LEUKO ACTVTN GolgiPlug (37℃迅速解冻)，震荡混匀后置于5%CO2培养箱培养5h。加入20μL CD8 PerCP-Cy5.5和5μL CD3 APC，震荡混匀后室温避光孵育15min；加入100μL Fix&Perm中的Reagent A，室温避光孵育15min，加入3mL PBS1200rpm离心5min，弃去上清，重悬后加入100μL Fix&Perm中的Reagent B后加入20μL的HU IL-17A PE，室温避光孵育15min，加入3mL PBS，1200rpm离心5min，弃去上清，500μLPBS重悬，采用流式细胞仪（Navios，美国）检测Th17占CD4+T淋巴细胞百分比。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 与健康对照组相比，肺癌组外周血Th17占CD4+T淋巴细胞百分比（0.92±0.49）%显著低于健康对照组（2.36±1.14）%（P＜0.05）, 见表1。

表1 肺癌组与健康组Th17占CD4+T淋巴细胞百分比的比较(±s，%)

表1 肺癌组与健康组Th17占CD4+T淋巴细胞百分比的比较(±s，%)

分组 Th17肺癌组 0.92±0.49对照组 2.36±1.14 t 24.42 P 0.00

2.2 肺癌患者放疗期间各阶段外周血Th17占CD4+T淋巴细胞百分比自放疗后显著下降，与放疗前相比具有显著性差异(P＜0.05)，见表2。图1显示某一肺癌患者放疗期间运用流式细胞仪检测外周血中Th17的分析图。

表2 放疗各阶段Th17占CD4+T淋巴细胞百分比的比较(±s，%)

表2 放疗各阶段Th17占CD4+T淋巴细胞百分比的比较(±s，%)

注：*与放疗前相比，差异有统计学意义，P＜0.05.

分组 Th17放疗前 1.28±0.42放疗第6次 1.03±0.35*放疗第12次 0.59±0.34*放疗第18次 0.56±0.35*放疗第24次 0.42±0.27*放疗第30次 0.32±0.29*F 24.42 P 0.00

图1 某肺癌患者放疗期间外周血中Th17占CD4+T淋巴细胞比例

3 讨论

CD4+T 细胞是效应 T 细胞的重要成分，根据效应细胞的生物学功能特征，将其分为Th1、Th2、调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）和Th17。Th17首次由Harrington等[2]于2005年首次发现，高水平表达 IL-23 受体(IL-23R)、IL-1 受体及 IL-18 受体，它的特异性转录因子是视磺醛酸相关的孤儿核受体 (ROR-γt)[3]。Th17通过分泌 IL-17、IL-21、IL-22、IL-23等多种细胞因子参与感染性、自身免疫性等疾病，近年来，其在肿瘤发生、发展中的作用也成为研究的热点。我们的研究发现，肺癌组外周血Th17占CD4+T淋巴细胞百分比低于健康对照组，这与Horlock[4]等在乳腺癌中的研究结果是一致的。Th17 可依靠细胞因子从外周血募集并活化中性粒细胞，促进内皮细胞分泌趋化因子，从而将细胞毒性T细胞浸润至肿瘤组织，进而抑制肿瘤的生长[5]。然而，也有研究认为在原发性肝癌、胃癌中，Th17的表达是增加的，且与肿瘤淋巴结转移及 TNM 分期、预后不良成正相关。Th17在肿瘤患者升高的原因可能为：肿瘤细胞高表达IL-6、IL-8等有利于Thl7分化和扩增的细胞因子及趋化因子等。Th17数量的增加，引起效应性细胞因子IL-17的分泌增加，诱导血管内皮细胞活化，促进新生血管形成；另外，Thl7也可通过NF-κB/ZEB1信号通路加速肿瘤细胞的侵袭和转移[6-8]。Th17在不同的肿瘤中表现出的作用形式不同，考虑与肿瘤类型的差异有关。Th17与肿瘤之间的关系复杂，促进或抑制肿瘤的过程及机制尚需进一步的探讨，如果明确二者的关系，将有利于发现更有效的肿瘤免疫治疗方法。

肺癌早期诊断较为困难，确诊时只有15%的患者能够手术治疗，对于无法手术的患者，放疗是主要的治疗措施[9]。放疗是利用放射线治疗恶性肿瘤的一种主要手段之一，在临床治疗肿瘤中异常重要。放疗在杀死肿瘤细胞的同时也会引起人体免疫细胞的改变，放疗能够增加部分免疫细胞的浸润，增强或抑制机体的抗肿瘤免疫功能[10]。我们的研究结果显示，肺癌放疗过程中，Th17于放疗早期既开始显著下降，说明Th17对于放疗非常敏感，但放疗期间下降不明显，不排除放疗期间急性肺损伤[11,12]所致，具体的机制尚不明确。在放疗过程中监测Th17的动态演变并适时联合免疫干预，能充分发挥抗肿瘤免疫效应细胞的功能，杀灭肿瘤细胞，改善患者的预后。Th17 联合放疗等治疗手段可能成为治疗肿瘤的免疫疗法的新途径。