不同来源的乙酰胆碱酯酶对农药灵敏度的影响

李绮敏 郑泽洋 林丹 杨安源

摘 要：通过提取苍蝇、鸡肝、蚯蚓血清、牛肉和马鲛鱼中的乙酰胆碱酯酶，配合农药残留检测仪，比较5种不同来源的乙酰胆碱酯酶对农药残留快速检测灵敏度的影响。结果表明：5种不同来源的乙酰胆碱酯酶对农药的灵敏度存在较大差异，蚯蚓血清中的乙酰胆碱酯酶对农药的灵敏度较强，对辛硫磷的灵敏度达0.2mg/kg，对敌百虫的灵敏度达0.1mg/kg。

关键词：农药残留;乙酰胆碱酯酶;酶抑制率法

中图分类号 Q814.4;S481+.8 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）16-0020-03

Effects of Acetylcholinesterase from the Different Sources on Pesticide Sensitivity

LI Qimin1，2 et al.

（1Guangdong Food Industry Institute Co.，Ltd，Guangzhou 511442， China; 2Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China）

Abstract： The effects of five different sources of acetylcholinesterase on rapid detection sensitivity of pesticide residues were obtained by extracting acetylcholinesterase from fly， the liver of chicken，the serum of earthworm ， beef and mackerel.The results showed that the sensitivity of five different sources of acetylcholinesterase to pesticides was different， the sensitivity of acetylcholinesterase to pesticides in the serum of earthworm was strong， and The sensitivity of phoxim can reach 0.2mg/kg，0.1mg/kg for trichlorfon.

Key words： Pesticide residue; Acetylcholinesterase; The method of enzyme inhibition

果蔬中农药残留超标的情况一直存在，究其原因：一是农户不按规定的用药量、次数、方法或安全间隔期施药，或施用不允许在果蔬上使用的剧毒、高度农药;二是现有标准施行的农药残留测定需要用大型分析仪器对有机溶剂进行提取、净化，无法对廉价的果蔬进行快速检测而导致监管不到位。而传统的农药残留分析方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人才，并且受到场地的限制。随着农药残留快速检测技术的出现，这些技术限制被打破。酶抑制率法在果蔬的农药残留快速检测中得到广泛应用，乙酰胆碱酯酶是酶抑制率法的重要组成部分。在国标GB/T 5009.199-2003的酶抑制率法中讲述了乙酰胆碱酯酶显色反应的原理，通过测定乙酰胆碱酯酶被抑制的程度来判断农药残留是否超标[1-2]。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE），又称真性胆碱酯酶，是一种膜结合蛋白，主要定位于细胞膜和突触前后膜，在生物神经传导中发挥着关键作用，能够高效水解神经递质乙酰胆碱（ACh），保证神经冲动在突触间的正常传导，故也称其为乙酰胆碱水解酶[3]。

乙酰胆碱酯酶广泛存在于各种动物组织中，如脑、脊髓、肌肉和红细胞。本研究选择苍蝇、鸡肝、蚯蚓血清、牛肉和马鲛鱼5种不同来源的乙酰胆碱酯酶，考察其对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药灵敏度的差异，为农药残留速测法酶源的选择提供参考[4-6]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 农药残留检测仪（广州万联生物科技有限公司），检测波长412nm;电子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司];恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）;移液器0.1～10mL;实验室用水为Milli-Q Tntegral超纯水;匀浆机（德国IKA公司）;涡旋振荡器（德国IKA公司）;3K15高速离心机（广州市科讯实验器材有限公司）。磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠硫代乙酰胆碱、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、12种农药标准品（购自广州分析测试中心），其余试剂为国产分析纯或生化试剂规格。苍蝇和蚯蚓线上购买，鸡肝、牛肉和马鲛鱼购于农贸市场。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液配制 12种农药标准品（100μg/mL）：3种氨基甲酸酯类（克百威、呋喃丹、灭多威）、9种有机磷类（乐果、氧化乐果、敌百虫、甲基异硫磷、敌敌畏、辛硫磷、对硫磷、甲胺磷、马拉硫磷），分别根据所需浓度用甲醇稀释成工作液。

1.2.2 磷酸盐缓冲溶液 分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

1.2.3 显色剂 分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢鈉，用20mL缓冲溶液溶解，于4℃冰箱中保存。

1.2.4 底物 取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。

1.3 原材料处理

1.3.1 苍蝇乙酰胆碱酯酶 取羽化3d的家蝇，以1∶7的长度比例剪取苍蝇头部，用缓冲溶液冰浴匀浆，得乙酰胆碱酯酶粗酶液;粗酶液通过Cleanert-TPT SPE小柱除去色素，得到澄清的乙酰胆碱酯酶液[7] 。

1.3.2 鸡肝乙酰胆碱酯酶 去除鸡肝中的脂肪，预冷用1.2.2制得的缓冲溶液，将处理好的鸡肝以料液比1∶1进行匀浆;在含5%的甘油磷酸盐缓冲溶液中加入非离子型表面活性剂得到混合液，称取上述步骤中的匀浆液，以料液比1∶4与混合液进行混合，得到以鸡肝为来源的乙酰胆碱酯酶液[8-9] 。

1.3.3 蚯蚓乙酰胆碱酯酶 将蚯蚓洗净后放入清水中24h，排净其体内粪便，按照匀浆液比为1∶1（蚯蚓质量（g）/磷酸缓冲液体积（mL））制成匀浆液，离心后弃去上清液，得到粗酶提取液;在10mL的离心管中加入1mL蚯蚓血清的粗酶提取液，再加入表面活性剂Triton X-114和缓冲溶液，用二级水定容至10mL;离心5min后分层将其上层溶液倾倒出去，下层溶液即为乙酰胆碱酯酶液[10]。

1.3.4 牛肉乙酰胆碱酯酶 去除牛肉中的脂肪，预冷磷酸盐缓冲溶液，将处理好牛肉以料液比1∶1进行匀浆;在含5%的甘油磷酸盐缓冲溶液中加入非离子型表面活性剂得到混合液，称取上述步骤中的匀浆液，以料液比1∶4与混合液进行混合，得到以牛肉为来源的乙酰胆碱酯酶液[11]。

1.3.5 马鲛鱼乙酰胆碱酯酶 将马鲛鱼去骨、去皮，得到其肌肉组织，预冷磷酸盐缓冲溶液，以料液比1∶1进行匀浆;在含5%的甘油磷酸盐缓冲溶液中加入非离子型表面活性剂TritonX-114（0.1%，w/v）得到混合液，称取上述步骤中的匀浆液，以料液比1∶4与混合液进行混合，得到以马鲛鱼为来源的乙酰胆碱酯酶液[12]。

1.4 农药灵敏度的测定

1.4.1 空白溶液测试 先于试管中加入2.5mL磷酸盐缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上，每组测试时间保持一致。加入0.1mL底物摇匀，此时溶液开始显色反应，立即放入农药残留检测仪中，记录在波长412nm处反应3min的吸光度变化值?A0。

1.4.2 待测溶液测试 先于试管中加入农药的标准工作液，其他操作与空白溶液测试相同，记录在波长412nm处反应3min的吸光度变化值?At，重复2次取平均值，计算抑制率。当抑制率≥50%时，表明蔬菜中存在一定浓度的有机磷或氨基甲酸酯类农药。

抑制率（%）=[（?A0-?At）/?A0]×100

2 结果与分析

2.1 苍蝇乙酰胆碱酯酶对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度 由表1可知，以苍蝇为酶源的乙酰胆碱酯酶对3种氨基甲酸酯类农药表现出较强的灵敏度，但在有机磷农药方面表现较差。当以1.3.1的方法提取苍蝇中的乙酰胆碱酯酶时，所得的酶液中干扰物质较多，也未进行纯化步骤，故对部分农药的灵敏度较弱。

2.2 鸡肝乙酰胆碱酯酶对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度 由表2可知，以鸡肝为酶源的乙酰胆碱酯酶对12种农药的表现欠佳，在国标GB/T 5009.199—2003给出的参考检出限下，只对对硫磷和敌百虫等表现出较强的灵敏度。

2.3 牛肉乙酰胆碱酯酶对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度 由表3可知，以牛肉为酶源的乙酰胆碱酯酶对12种农药的灵敏度较差，在国标GB/T 5009.199—2003给出的参考检出限下，仅对敌敌畏和呋喃丹表现出相应的灵敏度。

2.4 蚯蚓血清乙酰胆碱酯酶对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度 由表4可知，以蚯蚓血清为酶源的乙酰胆碱酯酶对比其他4种酶源，对12种农药均表现出较强的的灵敏度，其中，对敌敌畏、氧化乐果的灵敏度达到了国标GB/T 5009.199—2003中的参考检出限，对甲胺磷、克百威和呋喃丹的灵敏度高于GB/T 5009.199—2003中的参考检出限。

2.5 马鲛鱼乙酰胆碱酯酶对12种有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度 由表5可知，以马鲛鱼肌肉组织为酶源的乙酰胆碱酯酶对12种农药表现出相对较强的灵敏度，其中敌敌畏和辛硫磷达到了国标GB/T 5009.199—2003中的参考检出限，对氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威和呋喃丹均表现较强的灵敏度。

3 结论

试验结果表明，从具有代表性的昆虫或动物组织中分离得到的乙酰胆碱酯酶，均对有机磷或氨基甲酸酯类农药存在一定的灵敏度，但不同的酶源对12种农药的灵敏度存在较大差异，因此酶抑制率法农药残留快速检测与所用的酶源有密切的关系，在对乙酰胆碱酯酶的研究中可拓宽酶源的选择范围，筛选出对有机磷和氨基甲酸酯类农药灵敏度更强的农药。在制备酶液时，加入稳定剂甘油和非离子型表面活性剂TritonX-114，能较好地增强酶活，提高乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类的灵敏度。

酶抑制率法作为一种快速筛选方法，能快速确定农产品中是否存在农药残留。由于对部分农药的检测灵敏度较差，以单一酶源建立酶抑制率法测定农产品中农药残留，必然会造成部分残留农药不能检出，因而导致漏检或错筛。自制酶提取简便、价格低廉，但酶液不易保存，可以考虑在酶液中加入一定剂量的防腐剂，缩小不同批次酶液之间稳定性的差异。最好采用气相色谱等实验室检测手段，综合比较试验结果，对有怀疑的样品进一步用仪器法确证。

参考文献

[1]叶东平，陈斌，何正波.乙酰胆碱酯酶的分离纯化及生物学研究进展[J].安徽农业科学，2011（39）：3811-3814.

[2]刘永杰，张金振，曹明章，等.酶抑制法快速检测农产品农药残留的研究与应用[J].现代农业，2004，3（2）：25-27

[3]GB/T 5009.199-2003，蔬菜中有机磷和氨基甲酸醋类农药残留量的快速检测[S].

[4]田子华.酶抑制法农药残留快速检测技术研究[D].南京：南京农业大学，2005：27-33.

[5]张慧君，许学勤，徐斐，等.用于农药残留快速检测的两种酶的比较[J].分析化学，2004，32（11）：1517-1520.

[6]Golicnik M.，Fournicr D.，，Stojan J.Interaction of drosophila acctylcholinesterascs with D-tubocurarinc：An explanation of the activation by an inhibitor[J].Biochem，2001，40（5）：1214-1219.

[7]李昕，王英，张佳，等.家蝇中乙酰胆碱酯酶的提取纯化及应用研究[J].分析试验室，2008（03）：87-90.

[8]朱鸿，李想韵，邓玉，等.鸭肝丁酰胆碱酯酶的纯化与酶学性质研究[J].食品工业科技，2011，32（1）：95-99.

[9]周祖新，丁惠，周萍.鸡血中乙酰胆碱酯酶的提取比较[J].化學世界，2009（1）：49-51.

[10]张佳佳，黄惠华.鸡脑乙酰胆碱酯酶的性质及对氨基甲酸酯类物质的敏感性研究[J].食品工业科技.2016，37（12）：117-121.

[11]黄永春，刘红梅，彭神，等.胎牛血清乙酰胆碱酯酶的酶学性质研究[J].安全与环境学报，2009（4）：29-32.

[12]何东海，盂范平，朱小山.有机磷农药对海洋动物乙酰胆碱酯酶（AChE）的毒性效应研究进展[J].海洋学报，2003，12（6）：72-79.

（责编：徐世红）