UPLC-MS/MS、HPLC和ELISA法测定普洱茶中黄曲霉毒素研究

钟舒洁 陈晓嘉 周芳梅 罗小宝 陈茹 冯志强

摘 要：以市场随机购买的普洱茶为研究对象，采用酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）、超高效液相色谱-串联质谱联用法（UPLC-MS/MS）对普洱茶茶叶进行黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检测，分析3种方法检测普洱茶中黄曲霉毒素的适用性以及茶叶中黄曲霉毒素含量情况。结果表明，ELISA法测得结果为8.94～588μg/kg，HPLC法测得结果为0.318～0.677μg/kg，UPLC-MS/MS法结果均为未检出。UPLC-MS/MS法具有选择性强、重现性好、稳定性高的特点，对普洱茶茶叶这种基质复杂的样品进行测定，能减少杂質干扰，有效避免假阳性结果，更适用于检测茶叶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量。

关键词：普洱茶;黄曲霉毒素;酶联免疫法;高效液相色谱法;超高效液相色谱-串联质谱联用法

中图分类号 TS272.7 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）16-0015-05

Determination of Aflatoxin in Pu-erh Tea by UPLC-MS/MS， HPLC and ELISA

ZHONG Shujie1，3 et al.

（1Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China; 3Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China）

Abstract： In this paper， Pu-erh tea was purchased in the market as the main experimental object， using enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）， high performance liquid chromatography fluorescence detection （HPLC-FLD）， ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） for the determination of aflatoxin B1， B2， G1 and G2 in Pu-erh tea. Studied the three methods detection of aflatoxin in Pu-erh tea， applicability and aflatoxin content in tea. The result of ELISA method was 8.94-588μg/kg，the result of HPLC method was 0.318-0.677μg/kg， and the result of UPLC-MS/MS method was not detected. The UPLC-MS/MS method has the characteristics of strong selectivity， good reproducibility and high stability. It can reduce the interference of impurities and avoid false positive results. It is more suitable for the detection of the content of aflatoxin B1， B2， G1 and G2 in tea.

Key words： Pu-erh; Aflatoxin; Enzyme linked immunosorbent assay; High performance liquid chromatography; Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

普洱茶[1]是以云南大叶种晒青茶为原料，采用特定的加工工艺制成具有独特品质特征的茶叶，具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗辐射、抑菌、预防心脑血管疾病、增强免疫力、降脂减肥、降血糖、缓解烟毒危害等功效[2-4]。当前，普洱茶的质量安全问题倍受社会关注，近年来流传的“普洱茶致癌说”将质量安全问题推到了风口浪尖，是普洱茶生产、流通领域的重大挑战。黄曲霉毒素（aflatoxins）是自然界中已知的理化性质最稳定的一类真菌毒素，具有强毒性、致癌性、致突变性和致畸毒性，其中黄曲霉毒素B1的毒性最大[5-7]，被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构划定为一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一[8-10]。

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[11-12]，色谱法如薄层色谱法（TLC）[13]、高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）[14-16]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[17-23]和毛细管电泳法[24]等。茶叶基质复杂（含有多达数百种化学成分），杂质干扰严重，进行真菌毒素检测时容易出现假阳性，研究茶叶中真菌毒素含量是食品安全检测技术研究的难点和热点[25]。陈若恒等[26]采用免疫亲和柱净化-酶联免疫吸附（ELISA）法对荔湾区茶叶批发市场140份普洱茶AFTB1污染状况进行检测，阳性率为5.71%，检出值范围在2.03～4.29μg/kg。陈建玲等[27]采用免疫亲和柱净化-液相色谱法（HPLC）对抽取的70份湿仓储存普洱茶样本，检得黄曲霉毒素B1检出值范围在0.021～8.164μg/kg。李亚莉[28]采用多功能净化柱-超高效液相色谱质谱法（LC-MS/MS）对收集的30份发酵阶段样的普洱茶、市售普洱茶及受污染普洱茶进行黄曲霉毒素检测，均未检测到黄曲霉毒素。

本研究以市场随机购买的普洱茶为试验对象，采用酶联免疫法、液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法对普洱茶中的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2（AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2）进行检测，旨在探寻3种不同检测方法之间的差异性，以便在实际工作中合理选择适用的方法，提高结果准确性，同时为普洱茶质量安全及饮用安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters H-class（UPLC）超高效液相色谱仪（美国Waters公司）串联Triple Quad 3500超高液相质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）;Agilent 1200（FLD檢测器）高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;Vector PCX柱后衍生器（美国Pickering公司）;RT-6000酶标仪（德国IFP公司）;Turbo Vap LV 50位自动氮吹浓缩仪（瑞典Biotage公司）;AG204电子分析天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 试剂与耗材 黄曲霉毒素混标（纯度98%，美国O2SI公司）、乙腈（色谱纯，默克）、碘（分析纯，广州化学试剂厂）、氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）、十二水磷酸氢二钠（分析纯，天津市化学试剂一厂）、磷酸二氢钾（分析纯，广州化学试剂厂）、氯化钾（分析纯，广州化学试剂厂）、吐温-20（分析纯，阿法埃莎（天津）化学有限公司）、甲醇（分析纯，天津市化学试剂一厂）、氢氧化钠（分析纯，广州化学试剂厂）、黄曲霉毒素ELISA试剂盒（美国Romer Labs公司）、特异性免疫亲和柱（美国Romer Labs公司）。

1.3 样品采集 于2017年7—10月份随机抽取广州某茶叶市场共86批次普洱茶样品，其中生茶46批次，熟茶40批次。取一定量的茶样，经高速粉碎机磨细后过20目筛备测。

1.4 方法

1.4.1 酶联免疫吸附测定法（ELISA法） 参照ELISA检测试剂盒所提供的方法。主要检测步骤为：取5.0g待测样品加入25mL70%甲醇水溶液进行提取，超声30min，提取液用分析缓冲液按照1∶2比例进行稀释后，每个ELISA稀释孔中加入100μL样品、200μL酶连偶合物，充分混合后移取100μL混合液至有抗体包被的微孔中，同时设立标准品系列和对照反应孔，混合后于室温下孵育15min，再用蒸馏水或去离子水洗板5次后加入反应底物100μL，置室温下孵育5min后用终止液终止ELISA反应，在450nm波长下测定吸光度OD值。根据标准曲品系列浓度以及相关的OD值，绘出标准工作曲线，利用该标准曲线求出相应的含量值。

1.4.2 高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD法）

1.4.2.1 前处理过程 取5.0g待测样品加入25mL70%甲醇水溶液进行提取，超声30min，取2mL提取液加入18mL吐温溶液，全部过免疫性亲和柱，先用5mL PBS溶液和5mL水活化亲和柱后，上样，用2mL甲醇洗脱，抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气将洗脱液吹至近干，用50%甲醇水定容至1.0mL，旋涡1min复溶，过0.22μm有机滤膜压滤上机。

1.4.2.2 仪器条件 液相色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：水-甲醇-乙腈（56+22+22）;等度洗脱;流速1.0mL/min;进样量50μL;柱温40℃;激发波长360nm;发射波长440nm;柱后衍生器系统：衍生溶液：0.005% 碘液;衍生溶液流速0.3mL/min;衍生反应管温度90℃;激发波长360nm;发射波长440nm。

1.4.3 超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS法）

1.4.3.1 前处理过程 取5.0g待测样品加入25mL70%甲醇水溶液进行提取，超声30min，取2mL提取液加入18mL吐温溶液，全部过免疫性亲和柱，先用5mL PBS溶液和5mL水洗涤，再用2mL甲醇洗脱，抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气将洗脱液吹至近干，用50%甲醇水定容至1.0mL，旋涡1min复溶，压滤上机。

1.4.3.2 仪器条件 液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm），流动相：0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水，流速为0.5mL/min;进样量10.0μL;柱温40℃;梯度洗脱，见表1。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI+），正离子扫描方式，多反应监测模式（MRM），电喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，气帘气（CUR），压力为38psi，雾化气压力（GAS1）为55psi，辅助加热气压力（GAS2）为60psi。黄曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的其他相关质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 ELISA法测定结果 在随机抽取的86份茶叶样品中，采用ELISA法检测时，黄曲霉毒素全部呈阳性，最高检测含量为588μg/kg，检出率为100%（见表3）。ELISA法检测结果显示，所测茶叶中黄曲霉毒素均有检出。ELISA方法原理为酶标记抗体与载体上的抗原或抗体结合发生显色发应进行定性定量。ELISA法具有操作快速、简单并且成本低等优点，但对基质复杂的样品特异性不强，容易受基质干扰产生假阳性。茶叶中的酚类物质对抗原抗体反应有着严重的干扰，需要去除酚类物质的干扰才会得到准确的结论。

2.2 HPLC-FLD法测定结果 在随机抽取的86份茶叶样品中，采用HPLC-FLD法检测，结果显示，普洱茶生茶中有5份样品中黄曲霉毒素呈阳性，检出率为4.5%，阳性样品最高检测含量为0.677μg/kg（见表4）。液相色谱见图1、图2。

HPLC-FLD检测结果显示，5批次普洱茶生茶中检出AFTB2。HPLC-FLD法采用特异性免疫亲和柱进行净化，对目标物进行柱后衍生后进入荧光检测器进行分析检测，该方法相对ELISA法特异性更强，有效降低干扰。HPLC-FLD法原理是以分析物的保留时间作定性依据，由于实际样品测定时基质比较复杂，基质中的组分与分析物极性相似，从而保留时间相似，导致出现假阳性情况，使结果误判。而茶叶基质复杂（含有多达数百种化学成分），在液相色谱分析中容易在同一出峰时间产生杂峰，干扰影响定性结果。

2.3 UPLC-MS/MS法测定结果 在随机抽取的86份茶叶样品中，采用UPLC-MS/MS法检测，结果显示，全部样品检测结果均呈阴性，检出率为0（见表5）。质谱MRM离子见图3。

UPLC-MS/MS法具有选择性强、重现性好、稳定性高的特点，根据分子量信息及其特征离子进行定性定量分析检测，在串联四级杆多反应监测（MRM）模式下，所选的定量离子和定性离子具有很高的特异性，各目标物质分析时均不存在干扰。对茶叶这种基质复杂的样品能有效对目标离子进行准确定性，屏蔽杂质干扰，进而有效地避免假阳性或者假阴性结果。

2.4 3种检测方法的对比

2.4.1 检出限、定量限、回收率与精密度 本试验考察了酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱-荧光检测方法（HPLC-FLD）与超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱法（UPLC-MS /MS）的相关系数、回收率、精密度、检出限（LOD）和定量限（LOQ），其结果见表6。经标准曲线测试，ELISA法测4种黄曲霉毒素总量在0.1～40ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9985，LOD为1μg/kg，LOQ为3μg/kg;HPLC-FLD法在0.1～40ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9991～0.9996，LOD为0.1μg/kg，LOQ为0.5μg/kg;UPLC-MS/MS法在0.1～10ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9991～0.9997，LOD为0.03μg/kg，LOQ为0.1μg/kg。HPLC-FLD法进行0.1μg/kg、0.3μg/kg和1.0μg/kg添加水平的测定，加标回收率为48.3%～76.4%，谱图显示有明显的基质干扰，相对标准偏差（RSD）为3.1%～5.8%;UPLC-MS/MS法进行0.1μg/kg、0.3μg/kg和1.0μg/kg添加水平的测定，加标回收率为71.9%～86.7%，相对标准偏差（RSD）为2.4%～3.6%。综上所述，UPLC-MS/MS的灵敏度、回收率、重现性及稳定性都优于另外2种方法。

2.4.2 检测结果 从表7可以看出，ELISA法与HPLC法检测茶叶中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2均出现阳性结果，UPLC-MS/MS均为阴性结果。HPLC-FLD方法原理是利用分析物的保留时间作定性依据，外标物进行定量，茶叶样品基质复杂，基质中的组分与分析物极性等化学性质相同情况下会造成相似或相同的保留时间影响定性结果从而导致误判。UPLC-MS/MS方法原理采用分析物的保留时间和结构离子碎片作为定性依据，定性结果更为准确。在分析物定性方面，UPLC-MS/MS方法优于HPLC-FLD方法，样品经过特异性免疫亲和柱后，可有效去除茶叶的复杂基质，实现对目标物质的净化。在MRM扫描模式下，能准确、快速地检测茶叶中的黄曲霉毒素含量，有效地避免假阳性结果。免疫亲和净化-超高效液相色谱串联质谱法具有快速、准确、灵敏等特点，有助于提高食品检测实验室的分析效率，降低成本，从而为茶叶中的黄曲霉毒素含量的测定提供参考。

3 结论

本研究采用酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱-串联质谱联用法（UPLC-MS/MS）法对普洱茶样品进行黄曲霉毒素分析检测，分析3种方法检测普洱茶中黄曲霉毒素的适用性及普洱茶中黄曲霉毒素的含量情况。结果表明，ELISA法测得结果为8.94～588μg/kg，HPLC法测得结果为0.318～0.677μg/kg，UPLC-MS/MS法结果均为未检出。UPLC-MS/MS法具有选择性较强、重现性好、稳定性高、灵敏度高的特点，对茶叶这种基质复杂的样品能有效减少杂质干扰，有效避免假阳性结果。

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（责编：张宏民）