复凝聚法制备西番莲果皮花色苷微胶囊及其性质分析

孙 雪，张 蕊，范方宇，郭 磊，张雪春

（西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224）

西番莲是一种营养丰富的热带水果，其在加工中产生的大量果皮造成了一定的环境污染。西番莲果皮富含花色苷，花色苷具有抗氧化、抗肿瘤，预防糖尿病和心血管疾病等功效[1]，是一种优秀的天然可食用色素。以西番莲果皮为原料利用其花色苷，不仅可开发优秀的天然色素，还可解决废弃物的综合利用难题。

目前对西番莲果皮花色苷的研究以提取、分离纯化及对其稳定性的研究为主。如陈旭丹等[2]研究了西番莲果皮色素稳定性，揭示了西番莲果皮花色苷的稳定性较差。微胶囊技术可保护芯材，防止其被外界环境破坏，控制芯材释放[3]，微胶囊技术可为西番莲果皮花色苷的稳定性提供保障[4]。微胶囊的制备方法有原位聚合法、喷雾干燥法、复凝聚法、界面聚合法等[5]。其中复凝聚法是用两种或多种水溶性高分子材料的溶液，在适当的条件下，电荷中和，材料在溶液中凝聚，并将芯材包埋形成微胶囊。复凝聚法制备微胶囊工艺简单、条件温和、成本低高产率等[6]，在花色苷制备微胶囊技术中大量使用[7]。复凝聚法制备西番莲果皮花色苷微胶囊，可保障花色苷的稳定性，且为花色苷产品的多样化提供技术支撑。

基于此，以西番莲果皮花色苷为芯材，明胶和阿拉伯胶为壁材，采用复凝聚法制备西番莲果皮花色苷微胶囊，并分析了微胶囊的粒径、水分含量、形态及热稳定性等性质，以期为西番莲花色苷的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西番莲 云南省景洪市；乙醇（纯度≥99.7%）分析纯，广东光华科技股份有限公司；明胶 化学纯，国药集团化学试剂有限公司；阿拉伯胶 生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸 分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸 分析纯，成都金山化学试剂有限公司；冰乙酸（纯度≥99.5%） 分析纯，广东光华科技股份有限公司；100 U/g 的谷氨酰胺转氨酶（TG 酶） 泰兴市东圣食品科技有限公司。

HH-S4 磁力搅拌水浴锅 常州朗越仪器制造有限公司；JRA-650 超声波细胞破碎仪 无锡杰瑞安仪器设备有限公司；FJ200-SH 数显高速分散均质机上海沪析实业有限公司；B-290 喷雾干燥机 瑞士Buchi 公司；760CRT 紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Hydro 2000Mu 激光粒度仪 英国Malvern 仪器有限公司；SK2009 光学显微镜 深圳赛克数码科技开发公司；SPX-150B 恒温恒湿培养箱天津泰斯特仪器有限公司；SC-4800 扫描电镜 日本日立；DSC204F1 差示量热扫描仪 德国耐驰仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 西番莲果皮花色苷的制备 参考杨宗玲[8]的方法制备西番莲果皮花色苷。选取新鲜、色泽一致的西番莲果皮。50 ℃干燥12 h，干燥果皮粉碎，过60 目筛，取筛下样品，4 ℃密封保存。取干燥西番莲果皮粉，以液料比10 mL/g，加入86%酸性乙醇(0.054%盐酸+0.100%柠檬酸)，以提取温度50 ℃、超声时间37 min、超声功率190 W 提取花色苷，提取液5000 r/min 离心10 min。取上层清液，浓缩，将浓缩液（即粗提物）于−18 ℃避光保存备用。

1.2.2 花色苷微胶囊制备 参考纪秀凤[9]的研究方法，略有修改。分别配制一定浓度的明胶和阿拉伯胶溶液，按比例将明胶溶液与西番莲果皮花色苷混匀，10000 r/min 高速分散1 min，40 ℃水浴，加入一定比例阿拉伯胶溶液，混匀；10%冰乙酸调节反应pH，在一定反应温度下，200 r/min 搅拌30 min；将溶液迅速冷却至15 °C，加入一定量TG 酶固化3 h 即得复凝聚微胶囊。取反应后底部微胶囊溶液进行喷雾干燥，得西番莲果皮花色苷微胶囊样品。喷雾干燥条件：进风温度180 °C，出风温度90 ℃，进料流速9 mL/min。

1.2.3 花色苷含量测定 微胶囊中总花色苷测定[10]：取0.50 g 微胶囊样品溶于15.0 mL 蒸馏水，振荡溶解；滤液分别用pH 1.00 盐酸-柠檬酸缓冲液和pH 4.50 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释4 倍[11]；置于暗处平衡30 min，510 nm 和700 nm 测吸光值，利用公式（1）计算微胶囊中总花色苷含量。

微胶囊表面花色苷含量测定[12]：取0.50 g 微胶囊样品，用15.0 mL 振荡洗涤、过滤；滤液分别用pH1.00 的盐酸-柠檬酸缓冲液和pH4.50 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释4 倍；置于暗处平衡30 min，510 nm和700 nm 测定吸光值，利用公式（1）计算微胶囊表面花色苷含量。

采用pH 示差法[13−14]测定花色苷含量，以式（1）计算：

式中：ΔA-吸光度值之差，（A510–A700）pH1.00–（A510–A700）pH4.50；V-稀释最终体积，L；DF-稀释倍数，4；M-矢车菊素-3-葡萄糖苷相对分子质量，449.2；ε-矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔消光系数，26900；m-样品质量，g。

1.2.4 单因素实验 以包埋率为指标，固定条件为：芯壁比1:4、壁材质量比（明胶:阿拉伯胶质量比）1:1、壁材浓度1.5%、复凝聚pH 3.50、反应温度40 °C、反应时间30 min、TG 酶25 U/g 明胶。分别研究芯壁比1:2、1:3、1:4、1:5、1:6，壁材质量比2:1、3:2、1:1、2:3、1:2，壁材浓度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，pH 2.50、3.00、3.50、4.00、4.50，反应温度20、30、40、50、60 ℃，反应时间15、30、45、60、75 min，TG 酶添加量15、20、25、30、35 U/g 明胶对西番莲果皮花色苷微胶囊包埋率的影响。

1.2.5 Box-behnken 响应面优化试验 根据单因素实验结果，选择对微胶囊包埋率影响显著的芯壁比、壁材质量比和复凝聚pH 为自变量，以包埋率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析实验，优化工艺参数。因素和水平见表1。

表1 Box-Behnken 实验设计Table 1 Experiment design of Box-Behnken

1.2.6 性质的测定

1.2.6.1 包埋率 参考唐璐等[15]的方法，测定微胶囊包埋率，以式（2）计算：

1.2.6.2 粒径测定 将花色苷微胶囊在乙醇介质中分散均匀，采用激光粒度仪测定样品粒径。

1.2.6.3 水分含量 参考GB5009.3-2016《食品中水分的测定》直接干燥法测含水量。

1.2.6.4 形貌分析 将样品粘结在含导电胶的观测台，喷金，采用扫描电镜（SEM）在放大倍数3000 倍条件下观察微胶囊形态。加速电压设定10 kV。

1.2.6.5 热稳定性 利用差示扫描量热仪（DSC）分析微胶囊的热稳定性。取5～10 mg 微胶囊样品于铝制坩埚中，空坩埚为空白对照，扫描温度25～200 ℃，升温速度10 ℃/min，氮气流速20 mL/min[16]。

1.3 数据分析

实验数据均进行3 次平行。利用软件Design-Expert.V8.0.6.1 进行设计，软件IBM SPSS Statistics 20 对数据进行显著性分析，软件Origin 2017 对实验数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 芯壁比对微胶囊包埋率影响 图1 可见，随壁材增加，微胶囊包埋率呈先上升后下降趋势。芯壁比为1:5 时，微胶囊包埋率达到最大，为96.00%，芯壁比为1:6 时微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降。原因为壁材用量较低时，溶液中壁材含量较少，复凝聚反应时形成的凝聚物较少[17]，芯材未被完全包裹，造成芯材泄露附着在微胶囊表面，包埋率下降；当壁材过多时，微胶囊芯材相对较少，形成部分空囊，造成壁材浪费[18]。为确定适宜的芯壁比，选择1:4、1:5、1:6为响应面三水平。

图1 芯壁比对微胶囊包埋率的影响Fig.1 Effects of core/wall ratio on embedding efficiency of microcapsules

2.1.2 壁材质量比对微胶囊包埋率影响 图2 可见，随着阿拉伯胶用量增加，微胶囊包埋率呈先上升后下降的趋势。明胶:阿拉伯胶=1:1 时，包埋率上升至最高，为94.25%；当壁材比小于1:1 时，微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降，在明胶与阿拉伯胶质量比为1:2 时，包埋率下降到75.54%，下降了19.85%。明胶含量逐渐增加时，溶液中正电荷增多，正电荷与负电荷结合形成的复合物增加，当明胶:阿拉伯胶为1:1 时，溶液中净电荷含量最低，故包埋率最大，明胶含量逐渐减少，体系正电荷减少，包埋率降低[19]。为确定适宜的壁材质量比，选择3:2、1:1、2:3 为响应面三水平。

图2 壁材质量比对微胶囊包埋率的影响Fig.2 Effect of gelatin/gum Arabi ratio on embedding efficiency of microcapsules

2.1.3 壁材浓度对微胶囊包埋率的影响 图3 可见，壁材浓度0.5%～1.5%时，随壁材浓度的增加，微胶囊包埋率显著（P<0.05）增加，壁材浓度在1.5%时，出现峰值，包埋率为94.18%。因为壁材浓度过低，未能形成足够包裹芯材的微胶囊，存在空白复聚物，因此包埋率低。当壁材浓度大于1.5%时，微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降。因为壁材浓度过大，囊壁变厚，离子浓度增加，壁材自身形成大块凝胶，使包埋率下降[20]。故壁材浓度1.5%为宜。

图3 壁材浓度对微胶囊包埋率的影响Fig.3 Effects of the wall material concentration on embedding efficiency of microcapsules

2.1.4 pH 对微胶囊包埋率的影响 图4 可见，当pH为3.50 时，包埋率最大，为94.23%。pH<3.5 时，与pH为3.5 相比，微胶囊包埋率差异不显著（P>0.05）。因为阿拉伯胶分子结构上带有的-COOH 使其水溶液呈弱酸性，在水溶液中带负电[21]。明胶属于两性天然高分子材料，适当降低pH，可以使明胶分子电离正离子，加入与其电荷相反的阿拉伯胶，使明胶溶解度下降，形成微胶囊[20]。pH>3.50 时，微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降，因为明胶所带净电荷较少，难以与阿拉伯胶反应，微胶囊难以形成[22]，包埋率降低。为确定适宜的复凝聚pH，选择3.00、3.50、4.00 为响应面三水平。

图4 pH 对微胶囊包埋率的影响Fig.4 Effects of pH value on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.5 反应温度对微胶囊包埋率的影响 图5 可见，在20～40 ℃时，随着反应温度的升高，微胶囊包埋率显著（P<0.05）上升。当反应温度在40 ℃时，包埋率最大，为94.18%。原因为较低温度使壁材分子运动减弱[23]，不能形成完整微囊，芯材流出，包埋率下降。当温度大于40 ℃时，包埋率显著（P<0.05）下降，原因为温度过高，壁材稳定性下降，更易溶于溶液中，使壁材更易被破坏[24]，造成包埋率下降。故反应温度选择40 ℃为宜。

图5 反应温度对微胶囊包埋率的影响Fig.5 Effects of temperature on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.6 反应时间对微胶囊包埋率的影响 图6 可见，在15～30 min 时，随着反应时间的延长，微胶囊包埋率显著（P<0.05）上升，在30 min 时包埋率最大为94.23%，当时间超过30 min 时，微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降，在反应温度在75 min 时，包埋率下降为79.87%，下降了14.36%。原因为适当延长反应时间有利于微胶囊形成，但时间过长，已形成微胶囊黏连聚集，导致囊壁有破裂[25]，包埋率下降。故反应时间选择30 min 为宜。

图6 反应时间对微胶囊包埋率的影响Fig.6 Effects of time on the embedding efficiency of microcapsules

2.1.7 TG 酶添加量对微胶囊包埋率的影响 图7可见，TG 酶添加量在15～25 U/g 明胶时，随着TG 酶添加量增大，微胶囊包埋率显著（P<0.05）上升，当TG 酶添加25 U/g 明胶时，包埋率最高为94.19%。因为酶与蛋白质的作用位点充分结合，发生共价交联，微胶囊结构稳定[26]，包埋率达到最高；TG 酶添加量大于25 U/g 明胶时，微胶囊包埋率显著（P<0.05）下降，因为TG 酶添加量持续增加，酶添加量过高，使蛋白质交联过度，微胶囊粘连[27]，包埋率降低。故TG 酶添加量选择25 U/g 明胶为宜。

图7 TG 酶添加量对微胶囊包埋率的影响Fig.7 Effects of transglutaminase dosage on the embedding efficiency of microcapsules

2.2 响应面试验设计结果分析

2.2.1 模型建立与显著性分析 西番莲果皮花色苷微胶囊包埋率的响应分析实验根据Box-behnken 设计得到17 组实验，设计方案及结果见表2。利用软件Design-Expert.V8.0.6.1 进行回归拟合，得出以包埋率为响应值的回归方程（3）：

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

式中，A 为芯壁比，B 为壁材比，C 为复凝聚pH。

对模型进行方差分析，结果见表3。由表3 可以看出，实验选用模型具有高度的显著性（P<0.0001），失拟项=0.1817>0.05，失拟项不显著，表明回归方程对实验拟合较好，无失拟因素存在，各因素之间存在较强的交互作用；决定系数R2=0.9858，实验误差非常小，表明该模型拟合程度好，可对复凝聚法制备西番莲果皮花色苷微胶囊工艺过程的分析及预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

该模型可以看出A、B、C、A2、B2、C2对西番莲果皮花色苷微胶囊包埋率影响极显著（P<0.01），BC影响显著（P<0.05），AB、AC 不显著。

2.2.2 响应面交互作用分析 通过Design-Expert.V8.0.6.1 软件分析，各因素对西番莲果皮花色苷微胶囊包埋率影响的大小可通过响应面3D 图曲面图陡峭程度判断，曲面越陡峭，影响越大，反之则越小。由图8（a）响应面最为平滑，说明A、B 交互作用最小；图8（b）响应面较平滑，说明A、C 交互作用较弱；图8（c）响应面较陡峭，说明B、C 之间的交互作用最大。响应面结果与表3 中方差分析结果相吻合。根据表3 的分析结果，各交互因素对西番莲果皮花色苷微胶囊包埋率影响程度排序为：BC>AC>AB。

图8 各因素交互作用的响应面图Fig.8 Response surface plots for the interaction of various factors

2.2.3 验证试验 在壁材浓度1.5%、反应温度40 °C、反应时间30 min、 TG 酶25 U/g 明胶时，响应面实验结果表明，复凝聚法制备西番莲果皮花色苷微胶囊优化工艺参数为：芯壁比1:4.7，壁材质量比6:7，复凝聚pH 3.31，微胶囊预测包埋率为97.43%。

验证实验中，pH 取3.30 作为较佳的工艺参数。三次验证实验的微胶囊包埋率为96.83%±0.21%，与预测值相比，包埋率减小0.6%，结果基本一致，表明采用响应面法优化工艺获得的参数可靠，具有一定的实用价值。

2.3 西番莲果皮花色苷微胶囊的性质

2.3.1 微胶囊的基本性质 研究中西番莲果皮花色苷微胶囊的包埋率为96.83%±0.21%。微胶囊平均粒径为12.15±0.85 μm。Mahdavi 等[28]研究指出，微胶囊产品的水分对微胶囊的流动性、黏性及贮存期都有较大影响，本实验测得微胶囊水分含量仅为2.69%±0.35%，低于食品应用中粉末最低要求（4.00%）[29]。低水分能有效防止产品结块，使其具有良好的储藏稳定性。

2.3.2 表面形态分析 图9 可见，西番莲果皮花色苷微胶囊呈球形和椭圆球形，表面存在凹陷，褶皱较多，因为喷雾干燥过程中，水分快速蒸发，壁材不均匀收缩[30]。从图9 中分散的微胶囊可以看出，表面无裂痕、孔洞，结构完整，表明壁材对西番莲果皮花色苷具有良好的保护作用。

图9 微胶囊SEM 照片Fig.9 The SEM pictures of microcapsules

2.3.3 热稳定性分析 温度对微胶囊的稳定性有重要的影响。有研究表明西番莲果皮花色苷适宜在50 ℃以下保存[8]。图10 可见，微胶囊熔融温度为82.51 ℃，高于普通储藏温度（25 ℃），也高于西番莲果皮花色苷的适宜储藏温度（50 ℃）。研究表明微胶囊技术可以保护芯材，确保花色苷贮藏过程中的热稳定性，对西番莲果皮花色苷起到更好的保护作用。

图10 微胶囊DSC 曲线Fig.10 DSC curves of microcapsules

3 结论

本文通过Box-Behnken 响应面法优化西番莲果皮花色苷微胶囊的制备工艺，以包埋率为指标，建立的工艺为：芯壁比1:4.7，壁材质量比6:7，壁材浓度1.5%，复凝聚pH3.30，反应温度40 ℃，反应时间30 min，TG 酶25 U/g 明胶，此条件下，微胶囊的包埋率为96.83%。其粒径为12.15 μm、水分含量为2.69%，扫描电镜分析显示该微胶囊的表面光滑且呈球形结构、其熔融温度为82.51 ℃，常温下利于保存。