内质网应激在深静脉血栓小鼠中的作用

唐茂舜 朱车甫 陈东祥 郑 义 李建平

1.中国科学院大学深圳医院 （光明）神经外科，广东深圳 518106；2.中国科学院大学深圳医院 （光明）介入手术室，广东深圳 518106；3.中国科学院大学深圳医院 （光明）医学实验中心，广东深圳 518106；4.中国科学院大学深圳医院 （光明）心血管内科，广东深圳 518106

深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）是一种继心脑血管疾病之后最为常见的外周血管疾病，多发生在下肢，可继发于手术、创伤、恶性肿瘤、既往的深静脉血栓史等[1-2]。目前DVT的诊断主要还是通过患者的临床症状并借助辅助检查实现的，治疗上主要是采用抗凝药物、溶栓及手术取栓等综合手段，但这些措施并不能完全消除血栓形成后的一些症状[3-4]。年龄、肥胖、吸烟、静脉曲张等是DVT形成的危险因素，这些危险因素互相作用，致使血流滞缓，血管内皮缺氧缺血受损，血液凝度高，进而促使DVT发生[5-6]。而且目前研究认为静脉内皮细胞结构和功能的紊乱是DVT形成的始动因素[7]，特别是氧化应激引起的内质网应激反应是血管内皮损伤的重要原因[8]。因此探讨内质网应激在DVT形成过程中的作用对于DVT的发病机制及治疗将具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

32只清洁级C57BL/6小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 实验试剂与仪器

苏木素染液、伊红染色液均购于武汉博士德生物科技有限公司，批号：AR11800-1、AR11800-2；Scott蓝化液购于Solarbio公司，批号：G1865；Trizon Reagent购于北京康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0580S；TUNEL检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，批号：C1088；放射免疫沉淀法（RIPA）细胞裂解液购于北京普利莱基因技术有限公司，批号C1053；兔抗糖调节蛋白78（GRP78）、X盒结合蛋白1（XBP1）、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）多克隆抗体购于Affinity公司，批号：DF6025、AF5110、AF5366，稀释度均为1/1000；兔抗天冬氨酸水解蛋白酶3（cleaved caspase 3）多克隆抗体购于美国Abcam公司，批号：ab2302，稀释度1/1000；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购于北京中杉金桥生物科技有限公司，批号：ZB-2301。D1008E微型离心机购于SCJLOGEX；UV-1600PC紫外可见分光光度计购于上海美谱达仪器有限公司；TGL-16G低温高速离心机购于常州中捷实验仪器制造有限公司；Chemi DocTM XRS+超高灵敏度化学发光成像系统购于伯乐生命医学产品（上海）有限公司；DYY-6C蛋白垂直电泳仪购于北京市六一仪器厂。

1.3 实验分组及造模

将32只小鼠随机分为正常组、假手术组、模型组，正常组10只，假手术组及模型组各11只，其中各1只用于模型验证。模型组：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉剂（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰卧位放置在手术操作台上，消毒腹部，逐层开腹，将肠内容物挤出位于操作者左侧放置于生理盐水润湿的纱布上，暴露并分离下腔静脉，将分离出的下腔静脉与动脉同造模针头（直径0.3 mm，注射器针头）一起用4-0医用真丝编织缝合线结扎，迅速抽出针头，并将下腔静脉的可见分支进行结扎，关腹。假手术组：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉剂（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰卧位放置在手术操作台上，消毒腹部，逐层开腹，将肠内容物挤出位于操作者左侧放置于生理盐水润湿的纱布上，暴露并分离下腔静脉，关腹。正常组：小鼠不做任何处理。

1.4 取样

造模后24 h取各组小鼠下腔静脉组织，正常组和假手术组将左肾静脉至髂总静脉分叉处之间的下腔静脉段剪下，模型组小鼠取成血栓及其相应的下腔静脉组织，每组取3个样本置于10%福尔马林溶液中固定用于HE染色，Tunnel染色检测，每组取4样本置于-80℃中保存用于western blot检测。

1.5 HE染色

石蜡标本经流水冲洗数小时后，经梯度乙醇溶液脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡至透明。蒸馏水洗涤后，苏木精染色液进行染色，流水洗去染色液，1%盐酸乙醇进行分化，稍水洗，促蓝液返蓝，流水冲洗，伊红染色，蒸馏水稍洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，细胞核染蓝色，细胞浆染红色。

1.6 TUNEL染色

石蜡切片置于65℃烤箱烘烤2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度乙醇脱水。按TUNEL检测试剂盒说明书操作：切片置于湿盒中，加入Proteinase K工作液，37℃反应30 min。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤干净，吸水纸吸干PBS，滴加TUNEL检测液，45℃避光孵育2 h，PBS洗涤，封片显微镜下观察，绿色荧光为凋亡细胞，蓝色荧光为细胞核。

1.7 western blot检测细胞中蛋白表达

收集细胞，加入细胞裂解液于4℃摇床上作用细胞30 min，后用移液枪反复的吹打细胞20次左右，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液。配置浓缩胶及分离胶，2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（BCA）试剂盒检测蛋白浓度并定量，30 µg蛋白样品上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳直至目的蛋白分离，转聚偏氟乙烯膜30 min。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗溶液4℃过夜孵育，次日室温孵育二抗，将化学发光试剂加于膜上，于凝胶成像系统中曝光，并分析目的蛋白条（GRP78、XBP1、CHOP 及cleaved caspase 3）带灰度值。

1.8 统计学方法

应用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠HE染色结果

正常组及假手术组小鼠下腔静脉无血栓形成，血管内膜表面光滑、平整。模型组下腔静脉有混合血栓，主要为均匀分布的红细胞，红细胞之间有纤维素网状结构，并有白细胞、血小板散在；血管内皮细胞不连续，静脉周围有大量炎症细胞聚集。见图1。

图1 各组小鼠静脉组织HE染色结果（×200）

2.2 各组小鼠TUNEL实验结果

与正常组（2.35±0.13）%及假手术组（2.76±0.11）%比较，模型组小鼠静脉内皮细胞凋亡率（32.58±0.43）%上升，差异有统计学意义（F=12 776.949，P=0.000）。见图2。

图2 各组小鼠静脉组织TUNEL染色结果（×200）

2.3 各组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表达测定结果

与正常组及假手术组比较，模型组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3蛋白表达量上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表1。

图3 各组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表达测定结果

表1 各组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表达测定结果（±s）

表1 各组小鼠静脉组织中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表达测定结果（±s）

?

3 讨论

本研究通过小鼠下腔静脉狭窄法构建小鼠DVT模型，造模24 h后，发现模型组小鼠腹腔内肠系膜静脉明显扩张，管壁颜色变暗，结扎处下方血管明显肿胀，管壁颜色变暗，血管内有血凝块，HE染色发现模型组小鼠管内充满血栓，血管内皮细胞不连续，静脉周围有大量炎症细胞聚集，这些研究结果与文献报道基本一致[9]，也符合人体DVT急性期的病理表现[10]，说明本研究的造模成功。接着通过TUNEL实验发现模型组小鼠下腔静脉TUNEL阳性率高于正常组及假手术组，说明内皮细胞的凋亡在小鼠DVT的形成过程中发挥重要作用，但具体是由何机制所诱导的，本研究将进一步探讨。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中重要的细胞器，对膜蛋白、分泌蛋白的折叠与加工，钙的储存与释放具有重要调节作用，因此对细胞正常功能的维持至关重要。所以当内质网中蛋白的折叠、加工过程受阻，钙离子稳态被打破后会使细胞发生致死性的损害。缺血缺氧、钙超载、氧化应激等外界刺激均会使内质网功能发生障碍，进而触发内质ERS[11-13]。适度的ERS有助于未折叠蛋白或错误折叠蛋白的清除，并促进钙稳态的恢复，而过度的ERS导致未折叠蛋白或错误折叠蛋白聚集、钙稳态平衡被打破，内质网超负荷，并引起细胞凋亡。ERS主要通过激酶R样内质网激酶（PERK）、需肌醇酶1（IRE1）、活化转录因子6（ATF6）等3条信号通路发挥作用。在正常生理条件下，糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）通过与PERK、IRE1、ATF6结合形成复合物，阻断这些信号通路的传递。但在应激条件下，GRP78从复合物中解离出来，与未折叠或错误折叠蛋白结合，使得这些蛋白无法从ER中输出，同时这些信号通路被激活。其中激活的IRE1活化X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1），活化的XBP1激活CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）凋亡途径，最终将信号传递给Caspase家族，诱导细胞凋亡。而且非晶态二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），线粒体肿胀，内皮细胞凋亡，ER染色加强，GRP78、XBP1、CHOP、Capase-12表达量均上调，继而提示内质网应激诱导的凋亡途径可能是SiNPs诱导内皮细胞凋亡的机制之一[14]。所以说GRP78从跨膜蛋白上解离是ERS启动的第一步，因此GRP78在细胞内的高表达提示ERS的开始[15]。本研究通过western blot实验发现模型组较正常组及假手术组静脉组织中GRP78蛋白表达量上调，预示着ERS的开始促进了DVT的形成。另外本研究western blot实验结果还发现模型组中XBP1、CHOP蛋白表达量均上调，western blot实验结果表明DVT小鼠静脉组织中cleaved caspase 3蛋白表达量较正常组及假手术组上调，说明GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3介导的内质网应激反应所诱导的小鼠内皮细胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因。

综上所述，本研究发现内质网应激介导的内皮细胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因，且此过程是通过GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3信号进行传导的，但具体是如何进一步的调控有待于本课题组下一步研究。