二补助育汤对着床障碍小鼠子宫环氧化酶-2、过氧化物酶体增殖物激活受体δ的影响

申萌萌 刘雁峰 周雨玫 史亚婷 朱庆文

摘要 目的：探討二补助育汤对着床障碍小鼠内膜中环氧化酶-2（COX-2）、过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）表达的影响。方法：将C57妊娠小鼠随机分为空白、模型、阿司匹林、戊酸雌二醇片、二补助育汤高、中、低剂量组，每组8只，吲哚美辛油制备胚胎着床障碍小鼠模型，各组给予相应药物灌胃。妊娠第5天取小鼠子宫，观察外观形态、COX-2、PPARδ基因和蛋白表达。结果：模型组小鼠子宫苍白细长，串珠样改变少，且分布稀疏不均。各观察组小鼠子宫较模型组红润，有串珠状改变，串珠分布增多且不均。模型组COX-2和PPARδ蛋白表达低于空白组（P<0.05）;各观察组COX-2蛋白表达均高于模型组（均P<0.05）。二补助育汤低、高剂量组PPARδ mRNA表达较模型组、戊酸雌二醇片组明显增加（P<0.05），阿司匹林组PPARδ mRNA表达高于二补助育汤中剂量组（P<0.05）;二补助育汤各剂量组PPARδ蛋白表达高于模型组（P<0.01），其中中剂量组高于戊酸雌二醇片组和阿司匹林组（P<0.05）。结论：二补助育汤能够调节子宫内膜COX-2和PPARδ表达，提高子宫内膜容受性，有利于胚胎着床。

关键词 二补助育汤;着床障碍;吲哚美辛;小鼠;子宫形态;环氧化酶-2;过氧化物酶体增殖物激活受体δ;子宫内膜容受性

Abstract Objective：To explore the effects of Erbu Zhuyu Decoction on cyclooxygenase-2 （COX-2） and peroxisome proliferators-activated receptors δ （PPARδ） expression in mouse model of embryo implantation dysfunction.Methods：A C57 pregnant mice were randomly divided into a blank group，a model group，an aspirin group，a progynova group，a high-dose，a middle-dose and a low-dose groups，with 8 cases in each group.Embryo implantation dysfunction model was built with indomethacin.Mice in each group were administrated with corresponding medicine.The uteri were excised on 5th day of pregnancy to determine the expression of COX-2 and PPARδ.Results：The uteri in model group showed pale and slender.Beads changed little，and the distribution was sparse and uneven.Compared with the model group，the uterus of mice in each treatment group was rosier，with bead-like changes，and the distribution of beads was increased and uneven.The expression of COX-2 and PPARδ protein in the model group was lower than that in the blank group （P<0.05）; the expression of COX-2 protein in each treatment group was higher than that in the model group （all P<0.05）.The expression of PPARδ mRNA in the low-dose and high-dose groups of Erbu Zhuyu Decoction was significantly higher than that of the model group and estradiol valerate tablets group （P<0.05），and the expression of PPARδ mRNA in the aspirin group was higher than that of the middle-dose Erbu Zhuyu group （P<0.05）.The expression of PPARδ protein in each dose group of Erbu Zhuyu was higher than that of the model group （P<0.01），and the middle dose group was higher than that of estradiol valerate tablets group and aspirin group （P<0.05）.Conclusion：Erbu Zhuyu Decoction could improve endometrial receptivity by regulating COX-2 and PPARδ expression，improve the receptivity of the endometrium and be conducive to embryo implantation.

Keywords Erbu Zhuyu Decoction; Model of embryo implantation dysfunction; Indomethacin; Mouse; Uterus histomorphology; COX-2; PPARδ; Endometrial receptivity

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.009

子宫内膜容受性是指子宫内膜在特定时期内允许胚胎定位、黏附、侵入的复杂生理过程，是影响辅助生殖技术成功的重要因素[1-2]。因此，提高子宫内膜容受性对增加辅助生殖技术成功率具有重要意义。二补助育汤是名中医肖承悰教授治疗子宫内膜容受性低经验方[3]，临床研究示该方药能增加患者子宫内膜血供、纠正血栓前状态，提高再次体外受精-胚胎移植的成功率[4-6];实验研究表明该方通过同源框基因、内膜形态等靶点改善子宮内膜容受性[7-8]。

环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）是评估子宫内膜容受性的重要指标，在子宫内膜种植窗期呈高表达[9]，其缺失导致小鼠胚胎植入失败[10]。过氧化物酶体增殖物激活受体δ（Peroxisome Proliferators-activated Receptors δ，PPARδ）能与COX-2诱导产生的前列腺素结合，在胚胎种植过程中发挥重要作用[11]。因此，本实验以胚胎着床障碍小鼠为研究对象，研究二补助育汤对COX-2、PPARδ的影响，进而探讨该方药改善子宫内膜容受性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取56只SPF级未曾交配、6～8周龄、C57雌性小鼠。20只同周龄雄性小鼠，有生育能力，雌雄小鼠体质量分别为（20±2）g、（25±2）g。小鼠由北京维通利华实验技术有限公司提供[生产许可证号：SCXK（京）2012-0001]。小鼠饲养环境，湿度为5%～10%，温度（22±2）℃，12 h/12 h光照/暗循环，可以自由获取食物和饮水。经北京中医药大学东直门医院实验动物伦理委员会审批（伦理审批号：16-09）。

1.1.2 药物 阿司匹林肠溶片（Bayer S.p.A.，意大利，生产批号：H20090078）;戊酸雌二醇片（DELPHARM Lille S.A.S.，法国，生产批号：H20080108）;吲哚美辛油栓（北京双吉制药有限公司，生产批号：150407）;补助育汤颗粒剂（由补骨脂、骨碎补、川牛膝等药物组成），均购置于北京中医药大学东直门医院。

1.1.3 试剂与仪器 Anti-COX2/Cyclooxygenase 2（Abcam公司，英国，批号：ab15191）;Anti-PPAR delta（Abcam公司，英国，批号：ab23673）;兔超敏即用型二步法<非生物素>检测试剂盒[北京中杉金桥公司，货号：PV-9001（GBI）];SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix荧光定量PCR（Bio-Rad公司，美国，货号：Cat#A5000）。荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国，型号：CFX96）;光学显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：Olympus BX60）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 雌雄小鼠按2∶1比例于每天16：00进行合笼，次日清晨见阴栓者记为妊娠第1天（pd1）。按随机数字表法将56只妊娠小鼠，分为空白组、模型组、阿司匹林组、戊酸雌二醇片组、二补助育汤高、中、低剂量组，每组8只。空白组分别于pd3、pd4的9：00、16：00皮下注射0.13 mL麻油，余各组予以吲哚美辛麻油溶剂，制成胚胎着床障碍模型[12-13]。

1.2.2 给药方法 空白组和模型组每天给予0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL灌胃，戊酸雌二醇片组按每天0.006 mg/20 g体质量灌服，阿司匹林组按每天0.225 mg/20 g体质量灌服，二补助育汤低、中、高剂量组分别按0.213 g/20 g体质量、0.427 g/20 g体质量、0.853 g/20 g体质量的浓度灌服，pd1起连续5 d。pd5下午脱颈处死各组小鼠，裸眼观察子宫外观;每组5只小鼠，将子宫纵向剖开，投入10%中性甲醛备免疫组织化学检测。各组剩余3只小鼠，无菌条件下取全子宫，-80 ℃冻存，备实时定量PCR检测。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 子宫外观形态 观察子宫颜色、形态、胚胎着床情况等。

1.2.3.2 实时定量PCR技术检测子宫内膜COX-2、PPARδ mRNA表达 1）提取样本中总RNA，逆转录合成cRNA。2）实时定量PCR检测COX-2、PPARδ mRNA的表达。COX-2上游引物：ATCAGACCTTCCTTGTAT。COX-2下游引物：CACACTCATAGTTAAGACA。PPARδ上游引物：GGGTCTGAAGTCTCCAAA。PPARδ下游引物：AAGTTCCGTCAGTCTGTATA。GAPDH上游引物：TCAACGGCACAGTCAAGG。GAPDH下游引物：ACTCCACGACATACTCAGC。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s。采用2-△△Ct进行相对定量分析。

1.2.3.3 免疫组织化学检测COX-2、PPARδ蛋白表达 1）包埋;2）切片、贴片;3）脱蜡，封闭;4）一抗COX-2、PPARδ浓度分别为1∶800、1∶200，4 ℃过夜;5）PBS清洗;6）二抗：PV-9001（GBI），37 ℃，15 min;7）DAB显色，3～5 min;8）复染;9）脱水、封片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，多组间比较用方差分析，两两比较采用LSD法。COX-2 mRNA采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫形态观察 空白组小鼠宫体红润，胚胎着床处宫体局部膨大，串珠状、充血明显。模型组小鼠宫体苍白、细长，串珠样改变少、分布稀疏不均。与模型组比较，各观察组小鼠子宫颜色红润，有串珠状改变，串珠分布增多，且不均匀。见图1。

2.2 各组小鼠子宫COX-2表达 模型组小鼠子宫COX-2 mRNA表达低于空白组，各观察组表达均高于模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）。模型组COX-2蛋白表达较空白组明显降低（P<0.05），各观察组较模型组明显增加（均P<0.05），各观察组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图2～4。

2.3 各组小鼠子宫PPARδ表达 模型组小鼠子宫PPARδ mRNA表达低于空白组，但差异无统计学意义（P>0.05）。二补助育汤低、高剂量组和阿司匹林组PPARδ mRNA表达明显高于模型组（P<0.05）;与二补助育汤低剂量组比较，阿司匹林组明显增高（P<0.05）。与空白组比较，模型组PPARδ蛋白表达明显降低（P<0.05），各观察组较模型组均增加，其中二补助育汤各剂量组与模型组差异有统计学意义（P<0.05）。观察组间，二补助育汤中剂量组PPARδ表达明显高于戊酸雌二醇片组和阿司匹林组（P>0.05）。见图5～7。

3 讨论

子宫内膜容受性低是临床疑难杂症，肖老以经验方二补助育汤治之收效颇佳。肖老认为该病的病机主要是肾气亏虚、心气不足、胞脉不畅，因此用二补助育汤以“补肾气、通胞脉”[3]。全方由补骨脂、骨碎补、川牛膝、桑寄生、巴戟天、川续断等组成，方中补骨脂、骨碎补并称“二补”。补骨脂可温补脾肾、固精缩尿，骨碎补可补肾强骨、活血通络，两药合用有“补肾、活络”并用的寓意，具有补肾助孕、活血通脉的功效。川续断、桑寄生为肖老临床常用药对，川续断有补肝肾、强筋骨功效，桑寄生可补肝肾、通经络、安胎益血;二药合用既可补肝肾又可通经络，使补而不滞，还可固胞安胎。巴戟天温肾壮阳，可鼓动肾阳、促肾气化生。川牛膝补肾通络活血，并引诸药下入胞宫。全方整体上调节下丘脑-垂体-卵巢-子宫生殖轴，局部上促进胞宫胞脉与其他脏经间联系，改善内膜微环境，利于胚胎着床和发育。

有研究表明，COX-2和PPARδ在妊娠第4天子宫内膜基质中的表达一致，二者协同表达提示子宫内膜基质细胞内可能存在信号转导级联，且该信号级联参与调节着床过程[14]。COX-2是前列腺素生物合成中的限速酶，能够诱导花生四烯酸向前列腺素转化，产生前列腺素I2（Prostaglandins I2，PGI2）和E2（Prostaglandins E2，PGE2），PGs能够调控血管内皮生长因子表达[15-16]，促进血管生成，在胚胎着床、蜕膜化过程中发挥作用[17-18]。PPARδ是PGI2细胞核内受体，通过COX-2基因敲除小鼠的体内实验表明，COX-2诱导产生的PGI2通过PPARδ促进胚胎植入[19-20]。可见，三者间形成的信号级联对于胚胎植入和早期妊娠维持至关重要。本研究发现，吲哚美辛制成的胚胎着床障碍小鼠子宫蒼白、细长，孕体数目减少且分布稀疏，COX-2和PPARδ表达均降低。经二补助育汤、戊酸雌二醇片、阿司匹林治疗后，子宫颜色红润、孕体数目增多，COX-2和PPARδ表达均增高，尤以二补助育汤组明显，提示二补助育汤能通过调节子宫内膜COX-2和PPARδ表达，改善子宫内膜容受性。

综上所述，二补助育汤能提高胚胎种植窗期子宫内膜COX-2和PPARδ的表达，从而改善内膜容受性，有利于胚胎植入。更深入的机制，有待进一步研究。

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（2020-06-19收稿 責任编辑：王明）