UPLC-MS/MS法测定畜肉中莱克多巴胺

覃弘毅

摘 要：建立了超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）测定畜肉中莱克多巴胺的分析方法，样品经提取后通过PCX固相萃取柱净化。经C18色谱柱分离后，通过电喷雾离子源正离子模式（ESI+）进行多重反应离子监测（MRM）。以内标法定量。结果表明，莱克多巴胺的线性范围为0.5～10.0 ng/mL，相关系数r为0.999 77，定量限为0.25 μg/kg，加标回收率在100.2%～105.6%，相对标准偏差RSD（n=6）为4.0%～5.4%。本方法灵敏度高、操作简单、检测结果准确，可用于畜肉中莱克多巴胺的定量及确证分析。

关键词：畜肉;莱克多巴胺;超高效液相色谱-串联质谱

莱克多巴胺是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂，在临床上主要用于治疗支气管哮喘、充血性心力衰竭症和肌肉萎缩症等。在饲料中添加莱克多巴胺可使动物快速增长，减少脂肪含量，提高瘦肉率。2021年的3·15晚会曝光河北沧州青县“瘦肉精”羊肉流入郑州的新闻，其中检出的“瘦肉精”就是莱克多巴胺。若此类肉制品被消费者所食用，会对其身体健康造成损害[1]。

目前我国主要推荐使用GB/T 22286—2008进行畜肉中莱克多巴胺的监督抽检，但标准中实验步骤相对繁杂，耗时较长，對于技术人员实验操作要求较高。为此，需建立一种稳定性、重复性好，且效率较高的测定方法[2-4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莱克多巴胺标准溶液（100 μg/mL，Alta）、莱克多巴胺D3标准溶液（100 μg/mL，Alta），PCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，Agela）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（100 000 units，CNW）、甲醇（HPLC级，Merck）、乙腈（HPLC级，Merck）、乙酸铵（HPLC级，CNW）、甲酸（HPLC级，CNW）、氨水（HPLC级，CNW）、超纯水（Milli-Q制备）

1.2 仪器与设备

AB Sciex TripleQuad 4500三重四极杆质谱仪、Agilent Infinity 1290II超高效液相色谱仪、IKA MS3涡旋振荡器、Sigma 2-16 KL冷冻离心机、Biotage TurboVap 全自动样品浓缩仪、梅特勒 XS205DU电子天平

1.3 样品处理

称取2 g试样于50 mL离心管中，加入8 mL乙酸铵溶液（pH=5.2），混匀，再加入100 μL内标溶液（100 ng/mL）和50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下振荡16 h。再加入高氯酸调节pH值到1.0，于8 000 r/min下离心5 min，取全部上清液过PCX柱（依次用3 mL甲醇、3 mL水活化平衡），控制流速在3 mL/min，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液，抽干，用2 mL5%氨水甲醇洗脱。洗脱液于50 ℃下氮吹至干，加入1 mL5%甲醇水溶液，涡旋10 s混匀，过0.22 μm滤膜，上机处理。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）;流速：0.4 mL/min;进样体积：5 μL;柱温：35 ℃;流动相A：0.1%甲酸水;流动相B：0.1%甲酸乙腈;梯度洗脱程序：0～1 min，90%A;1～1.1 min，90%～80%A;1.1～2.2 min，80%A;2.2～2.8 min，80%～5%A;2.8～3.3 min，5%A;3.3～3.4 min，5%～90%A;3.4～4.0 min，90%A。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）;扫描模式：多反应离子监测（MRM）;温度（TEM）：550 ℃;喷雾电压（IS）：5 500 V;气帘气（CUR）：30 psi;雾化气（GS1）：55 psi;辅助加热气（GS2）：55 psi。莱克多巴胺及其内标的质谱参数见表1，莱克多巴胺及其内标的提取离子色谱图见图1。

2 结果与分析

2.1 内标的选择

在现行标准中使用较多的GB/T 22286—2008，采用沙丁胺醇D3作为莱克多巴胺的内标进行计算。然而由于性质上存在差异，其回收率不高，且不稳定，因此本次实验采用莱克多巴胺的同位素氘代物作为内标，其在性质上更接近本体，因此回收率更好、更加稳定。

2.2 前处理条件的优化

GB/T 22286—2008实验步骤中，经高氯酸调节pH后的样品溶液，需使用氢氧化钠溶液调节pH，使莱克多巴胺转化为分子态，再经异丙醇-乙酸乙酯溶液萃取浓缩，复溶后作为固相萃取上样溶液。本次实验直接使用经高氯酸调节pH后的样品溶液作为上样溶液，省去了国标方法中的后续步骤，节省前处理时间。根据实验原理，高氯酸调节pH为酸性后，莱克多巴胺已成离子状态[5]，满足PCX对上样溶液中目标物形态的要求，确保能够吸附目标物。实验结果表明，该方法的灵敏度及准确度也未受到明显影响。

2.3 线性范围、定量限、回收率和精密度

精密移取莱克多巴胺和莱克多巴胺D3标准品溶液适量，相应稀释成0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，其中各工作曲线溶液中内标的浓度为10 ng/mL。依次上机测定，拟合线性回归方程见图2，为y=0.201 89x-7.582 13×10-4。

在空白样品中加入适量标准品溶液。经测定后，以满足信噪比（S/N）>10且添加回收率RSD（n=6）≤20%的最小加标水平作为本方法的定量限（LOQ）。分别按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ这3个加标水平进行加标实验，每个浓度水平设置6个平行试样，结果均满足GB/T 27404—2008中关于方法确认的要求[6]，详见表2。

2.4 实际样品测定

取100份样品作为实际样品测试，其中50份为猪肉、30份为牛肉、10份为羊肉、10份为猪肝，均未检出莱克多巴胺。盲样测试结果为4.82 μg/kg，准确度为109%。

3 结论

本文以常见畜肉为分析样本，建立了以莱克多巴胺为分析目标物的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法准确度高、重复性好、稳定、快捷、定量限满足国家标准要求。在实际应用中，可为在畜肉中非法添加莱克多巴胺的食品安全处置工作提供高通量的技术手段。

参考文献

[1]佚名.食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单[N].中国食品安全报，2011-04-26（A3）.

[2]潘胜东，叶美君，王立，等.混合型阳离子交换固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定肉样中特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗残留[J].中国卫生检验杂志，2018，28（23）：2841-2844.

[3]马月姣，梁雪燕，孙晓娟，等.莱克多巴胺检测方法研究进展[A].中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会.[C]//中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十五次学术讨论会论文集.北京：中国畜牧兽医学会，2019：3.

[4]国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法：GB/T 22286—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[5]陈小华，汪群杰.固相萃取技术与应用[M].北京：科学出版社，2010.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.