改性黄腐酸/凹凸棒石复合材料的制备及其抑菌性能

杨芳芳，张 倩，宋亚萌，惠爱平，康玉茹，王爱勤

(1.中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃省黏土矿物应用研究重点实验室，兰州 730000；2.中国科学院兰州化学物理研究所盱眙凹土应用技术研发中心，淮安 211700；3.兰州大学第二医院检验医学中心，兰州 730000)

0 引 言

在过去的半个多世纪，抗生素被大规模用于动物养殖业，在预防和治疗动物传染性疾病，促进动物生长及提高畜牧业经济效益等方面发挥了重要作用[1-2]。然而，抗生素在养殖领域长期和过度使用造成了严重的细菌耐药性及药物残留，对食品安全和公共卫生安全构成了威胁[3]。我国2020年7月起已全面禁抗。基于此，开发抗生素类促生长剂替代品迫在眉睫。

黄腐酸(fulvic acid, FA)又称富里酸，是一类分子量较小、活性官能团丰富和药用价值较高的复合有机酸。FA作为饲料添加剂，毒性较低[4]，能够提高机体抗氧化能力[5]，可抑制和杀灭肠道内的病原菌，维持肠道微生物区系的平衡，从而增强机体对营养物质的消化吸收，提高免疫力，促进动物生长[6]。然而其广谱抑菌性有待进一步提升。

凹凸棒石(attapulgite, APT)是一种天然的一维纳米含水富镁铝硅酸盐黏土矿物。APT能够促进肠黏膜修复，增强动物抗病能力[7-8]。APT独特的棒晶形貌和孔道结构，既可以做功能复合抑菌材料的载体[9-10]，又可吸附抑菌活性成分，进而增强材料的抑菌性能[11-12]。为此，本文利用APT的吸附性能将FA负载于APT，同时采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)进行改性，获得了具有一定广谱抑菌性能的FA/APT复合抑菌材料。

1 实 验

1.1 材料与试剂

APT来自盱眙欧佰特粘土材料有限公司，其主要化学组成(质量分数)为Al2O310.73%，MgO 9.70%，CaO 0.49%，SiO260.83%，K2O 1.18%，Fe2O35.71%。FA来自山东创新腐植酸科技有限公司，纯度为95%(质量分数)以上。CTAB购自成都市科隆化学品有限公司，分析纯。金黄色葡萄球菌(S.aureus, ATCC25912)和大肠杆菌(E.coli, ATCC25922)由兰州大学第二医院提供，Luria-Bertani营养肉汤(LB)培养基和营养琼脂(nutrient agar, NA)培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 试验仪器及测试方法

试验仪器包括MS204TS电子分析天平、RT10多点磁力搅拌器、DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱、TDL-50C低速大容量离心机。傅里叶变换红外(FT-IR)光谱由Thermo Nicolet 6700型红外光谱仪(波长为4 000～400 cm-1)测定，Zeta电位由ZEN3600 Zeta电位分析仪(633 nm He-Ne激光辐射)测定，复合材料的表面积和孔隙体积用ASAP2020全自动比表面积及微孔物理系吸附仪(N2，196 ℃)测定，热重分析(TGA)在PerkinElmer STA 8000同步热分析仪(N2气氛，工作温度为室温至800 ℃，升温速率为10 ℃/min)上测定。

1.3 FA/APT复合材料制备

在300 r/min搅拌速率下，6个100 mL烧杯中分别加入20 mL去离子水和0.2 g FA粉末，完全溶解后再分别加入1 g APT粉末，分散完全后依次加入0.5%、1%、5%、10%、15%和20%(相对于APT质量)的CTAB。上述混合液搅拌5 min后超声分散30 min，再继续搅拌6 h后将混合液在转速为4 000 r/min的离心机中离心10 min，用去离子水洗涤3次，60 ℃干燥12 h，研磨过200目(75 μm)筛，所得样品依次标记为FA/APT-1、FA/APT-2、FA/APT-3、FA/APT-4、FA/APT-5和FA/APT-6。未经CTAB改性的样品标记为FA/APT。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)评价

FA/APT复合材料抑菌性能评价采用最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)法[12]，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为代表革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的试验菌株。平板中样品的最终浓度如下：大肠杆菌组浓度为5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL，金黄色葡萄球菌组浓度为1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.01 mg/mL。最后用移液枪吸取1 μL的上述菌悬液(含菌量约为1×104CFU/mL)，点种于含待测样品的琼脂平板中，每个培养皿接种3个点。将所有平板移至恒温培养箱中培养，在37 ℃下培养16～24 h后，观察细菌生长情况，完全抑制菌落生长的最低样品浓度为所得样品的MIC值。试验过程中建立不含样品的阳性对照组和空白对照组。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

2.1.1 红外光谱分析

图1 FA、APT、FA/APT复合材料的FT-IR谱和局部放大图Fig.1 FT-IR spectra of FA, APT, and FA/APT composites and the partial enlarged detail

2.1.2 热重分析

图2是APT、FA/APT和不同浓度CTAB改性FA/APT复合材料的TGA和DTG曲线。由图可见，对于APT，200 ℃以下的质量损失主要归因于表面吸附水和沸石水的脱除，230 ℃和450 ℃左右的质量损失是由于配位水和结构水的脱除。FA/APT和CTAB改性后的FA/APT复合材料在70～90 ℃之间的质量损失同样归因于吸附水的脱除；在200～500 ℃之间的质量损失除了APT中配位水和结构水的脱除外，还有FA和CTAB分解的贡献；随着CTAB添加量的增加，复合材料在此区间的质量损失率增大，特别是对于FA/APT-5和FA/APT-6，由于吸附CTAB的量大幅增加，在200～300 ℃区间的热降解最为明显。热重分析结果进一步表明，FA被成功负载到APT上，同时CTAB也作用于FA/APT复合材料，实现了FA/APT复合材料的改性。

图2 APT和FA /APT复合材料的TGA和DTG曲线Fig.2 TGA and DTG curves of APT and FA/APT composites

2.1.3 Zeta电位分析

FA、APT、FA/APT和不同浓度CTAB改性FA/APT复合材料的Zeta电位如图3所示。由图可见，FA和APT均带负电荷，分别为-55.13 mV 和-20.93 mV，当二者结合后Zeta电位仍为负值。当FA/APT被阳离子表面活性剂CTAB改性后，随着CTAB添加量的增加，Zeta电位逐渐增大。Zeta电位的调节有利于增强复合材料与细菌的界面作用，从而增强FA/APT的抑菌作用。

图3 FA、APT和FA/APT复合材料的Zeta电位Fig.3 Zeta potentials of FA, APT, andFA/APT composites

2.1.4 比表面积分析

表1列出了实测的APT负载FA前后以及CTAB改性FA/APT后复合材料比表面积和孔结构参数。相比于APT，FA/APT的比表面积(SBET)、外比表面积(Sext)和总孔体积(Vtotal)均明显减小，尤其是微孔比表面积(Smicro)急剧降低，说明FA分子被成功负载到APT上。经CTAB改性后，FA/APT的SBET、Sext和Vtotal随CTAB添加量的增加而呈现规律性的减小，表明CTAB分子结合到FA/APT复合材料上。此外，CTAB改性后复合材料的Smicro急剧降低；当CTAB添加量为5%时，微孔表面积消失。该结果表明CTAB分子同时进入到了APT的外部通道和内部孔道[16]。

表1 APT和FA/APT复合材料的比表面积和孔结构参数Table 1 Specific surface areas and pore structural parameters of APT and FA/APT composites

2.2 抑菌性能和机理分析

FA、APT、FA/APT和不同浓度CTAB改性FA/APT复合材料的MIC见表2。可以发现，FA和APT对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均大于5 mg/mL，FA负载到APT后复合材料的抑菌性能没有明显提升。采用CTAB改性后，复合材料对金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显增强，并随着CTAB添加量的增加，MIC值明显减小。当CTAB用量为5%时，复合材料对金黄色葡萄球菌的MIC可达0.25 mg/mL；当CTAB用量为15%时，MIC可达0.05 mg/mL。但采用CTAB改性后复合材料对大肠杆菌的抑制作用较弱，当CTAB用量达到15%后，对大肠杆菌的抑菌作用才较为明显(MIC为1 mg/mL)。图4展示了FA/APT-5(15%)和 FA/APT-6(20%)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度测试平板数码照片。

表2 FA、APT和FA/APT复合材料的MICTable 2 MIC values of FA, APT, and FA/APT composites

图4 FA/APT-5和FA/APT-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度测试Fig.4 MIC tests of FA/APT-5 and FA/APT-6 against E. coli and S. aureus

通过上述分析可知，FA和APT对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用相对较弱，这与文献中报道基本一致。蔡防勤等[17]曾采用肉汤和血清肉汤培养基对巩县FA的抑菌性能进行了评价，结果证明，巩县FA在高浓度时对金黄色球菌、肺炎双球菌和流感杆菌具有抑制作用，而对大肠杆菌、绿脓杆菌等8种细菌无抑制作用。高金岗等[18]比较了生化FA和常见抑菌药品的抑菌效果发现，生化FA浓度≥40 mg/mL 时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、苏云金杆菌及枯草杆菌均有明显的抑制作用。Enerkom(Pty)公司采用湿法氧化将烟煤转化为高质量的FA，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度可达15 mg/mL[19]。可以看出，不同来源FA的抑菌性能具有差异性，但均在较高浓度时会产生抑菌效果。相对于体外抑菌性能的评价，国内外关于FA在动物生产中应用的实验研究报道较多。Qin等[20]评价了FA对药物致泻模型小鼠的抗腹泻作用，发现FA中的含氧官能团尤其是酚羟基和羧基，以及其分子量分布、胶体性质和收敛性，是其发挥抗腹泻活性的物质基础。诸多研究[21-24]发现，饲粮中添加FA能够改善畜禽和水产动物的生长性能和肠道健康状况，这主要归因于FA中含有的多种活性功能基团可提高肠道内消化酶活性，进而促进氧化还原和新陈代谢，还可通过抑制病原微生物消除炎症。

APT在改善动物肠道健康和生产性能方面已有大量报道[25-26]，特别是APT可替代抗生素防控仔猪腹泻[27]。虽然APT本身的抑菌作用较弱，但其作为载体能够有效提升抑菌类材料的抑菌性能[28]，归因于其良好的吸附作用，能够增强抑菌材料与病原菌之间的界面作用[29]。

季铵盐是一类具有很强表面活性的阳离子表面活性剂和抑菌剂，其化学结构带有正电荷和疏水区域，能够吸附穿透细胞壁，溶解细胞膜，造成细菌内容物的泄漏，进而导致细菌死亡[30]。本研究采用CTAB改性后，复合材料抑菌性能明显得到了改善。其中，在低浓度CTAB改性下，复合材料对金黄色葡萄球菌具有较强抑制作用，而对大肠杆菌的抑制作用则要CTAB浓度大于10%时才较为明显，这主要是由两种细菌的细胞壁结构和成分不同所造成的。大肠杆菌含有脂多糖和脂蛋白组成的外膜，而金黄色葡萄球菌不存在这种外膜。当CTAB吸附到细菌后，必须先溶解外膜，然后与内膜作用，因此金黄色葡萄球菌通常比大肠杆菌更敏感[31]。综上所述，将具有高生物活性的FA引入到载体APT中，并结合CTAB改性，通过三者的协同作用，复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出抑菌活性，具有一定的广谱抑菌作用。

3 结 论

本文以APT为载体，通过吸附法实现了FA的负载和复合材料的改性。FA和CTAB分子主要通过静电吸附方式负载于APT，CTAB的引入实现了FA/APT复合材料的电荷调控。CTAB用量越大，FA/APT复合材料的抑菌性能越强，且对金黄色葡萄球菌比大肠杆菌更敏感。当CTAB添加量为15%时，复合材料对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度可达0.05 mg/mL。该复合材料的协同效应赋予其一定广谱抑菌作用，在动物健康养殖方面具有广阔的应用前景。