紫菀中有效成分紫菀酮含量的时空变化规律

2021-09-11张笑玲孟义江贾凯旋白旭瑞葛淑俊

江苏农业科学 2021年16期

关键词：紫菀

张笑玲孟义江贾凯旋白旭瑞葛淑俊

摘要：利用高效液相色谱（HPLC）法测定紫菀不同发育时期和不同组织部位的紫菀酮含量，探索药用植物紫菀中紫菀酮积累的时空动态规律，为解析紫菀酮合成机制提供理论基础。结果表明，不同部位紫菀酮含量差异显著，紫菀酮主要在根茎中积累，不定根和根状茎紫菀酮含量均高于地上各部位，含量表现为根>根状茎>芦头>叶片>叶柄，叶片中有大量紫菀酮合成，并最终在根中积累，叶柄中没有紫菀酮积累，只参与叶片中紫菀酮向下运输过程;不同时期根部紫菀酮含量差异明显，未抽薹紫菀动态变化趋势为高—低—高，抽薹紫菀动态变化趋势为高—低—高—低—高，越年生紫菀根部紫菀酮含量低于一年生紫菀。紫菀酮積累受不同部位、不同时期、不同年限及抽薹开花的影响，综合质量评价一年生未抽薹紫菀的根及根茎更适用于入药，紫菀最佳采收期为10月中下旬，本研究为紫菀的高效利用提供了理论基础。

关键词：紫菀;紫菀酮;时空变化规律;HPLC法

中图分类号：R284 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0174-05

紫菀（Aster tataricus L. f.）为菊科紫菀属草本植物，以干燥根茎入药，始载于《神农本草经》，被列为中品，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、利尿和抗溃疡等作用[1]，主产于河北省安国市和安徽省亳州市[2]。紫菀中含有化学成分100余种，其中三萜类紫菀酮是紫菀中特有成分，主要在根及根茎中积累，《中华人民共和国药典》中规定紫菀酮含量不低于0.15%。目前关于紫菀酮含量的测定方法[1]、不同种源中含量的差异[3]以及紫菀酮的药理作用[4]等研究较多，但关于紫菀酮合成代谢的机制尚未明确。本研究以课题组筛选到的稳定紫菀株系为材料，采用芦头和根茎播种，分时期测定地上和地下各部位中紫菀酮的含量，研究紫菀酮积累的时空变化规律，以期为解析紫菀酮合成机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以本课题组选育的生长一致、紫菀酮含量稳定的株系紫菀1601为材料，经河北农业大学杨太新教授鉴定为紫菀（Aster tataricus L. f.）。以不同发育时期紫菀样本为试验材料做后续分析。

1.2 试验仪器

紫菀酮含量测定所用仪器为LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括LC-20AD输液泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A 检测器、CBM-20Alite控制器、LC solution工作站）、Sartorius BS223S电子天平、WH-986A静音混合器（上海新诺仪器集团有限公司）、SK5200H超声仪、高速离心机（德国Eppendorf 5417C）;所用试剂有甲醇、乙腈，均为色谱纯，紫菀酮标准品（中国药品生物制品检定所提供，Cas-10376-48-4）。

1.3 试验方法

1.3.1 紫菀栽种和管理 2018年3月28日在河北省安国市中药都药博园内栽种，沙壤土，底施有机肥1 000 kg/667 m2，氮、磷、钾复合肥50 kg/667 m2，深翻整平。栽种行距为30 cm，穴距为15 cm，每穴栽种3个带芽根茎节段或带芽芦头。田间管理同大田。

在紫菀出苗后每隔30 d取样1次，每次挖取3株，测量新生叶片和叶柄长度，抖净泥土，冲洗后用滤纸吸干水分，取叶片、叶柄、芦头、不定根和根茎等部位，烘干，研磨，过40目筛备用。

1.3.2 紫菀酮含量的测定对照品溶液制备：精密称取紫菀酮标准品25 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释，并定容至刻度，超声30 min，置于40 ℃恒温水浴锅直至溶解，摇匀，即得标准品溶液[5]。

供试样品溶液制备：精密称取样品粉末0.1 g置于2.0 mL离心管中，加入1 mL甲醇溶液，超声 30～60 min，4 ℃摇匀过夜，12 000 r/min离心 30 min，取上清液用微孔滤膜（0.45 μm）过滤后置于样品瓶中待用。

紫菀酮含量测定：参照笔者所在实验室建立的高效液相色谱（HPLC）法测定[4]。色谱条件为Polaris C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱温箱温度为40 ℃;检测波长为200 nm;流速为1.0 mL/min;流动相乙腈 ∶ 水=96 ∶ 4（体积比）;进样体积为20 μL;液相色谱（LC）结束时间设为50 min。

2 结果与分析

2.1 紫菀植株生长发育情况

紫菀春季栽种后20～30 d出苗。由图1可知，前期生长较慢，5月中下旬紫苑植株有3叶1心，第1条母根和次生根逐渐发育（图1-A1）;6月植株叶片形成速度加快，分蘖增加，芦头和根状茎开始形成（图1-A2）;7月植株进入封垄期（图1-A3），叶片和不定根迅速增多，芦头增大，不定根和根状茎呈白色，之后根系颜色逐渐变深（图1-A4），图1-A4-1 为未抽薹紫菀，图1-A4-2为抽薹紫菀，抽薹紫菀进入盛花期;9月植株根系进入快速发育期，根茎明显伸长，次生根数量大量增加，根系颜色紫红（图1-A5）;10月后地上部生长基本停止，叶片变黄，地下根系持续伸长和增粗，根茎数量增加（图1-A6）;11月中旬植株叶片枯萎，根系颜色紫红，根茎数量显著增加（图1-A7）;12月中旬，在气温降至0 ℃以下后根系停止生长（图1-A8）。春季返青前，根系和根茎颜色紫红，根状茎芽眼饱满。下面用A1～A9表示对应的各个时期，A9为春季返青前。

在紫菀生长过程中，新生叶的叶柄长度和叶片长度的比值有明显变化，叶柄变短现象更有利于地上部紫菀酮向地下部运输。由图2可知，3叶1心时期植株新生叶叶柄较长，叶炳长与叶长的比值为1.50，之后叶柄逐渐变短，至8月植株进入旺盛生长期时新叶叶柄和叶片长度之比降为1.00;之后形成的新叶其叶柄和叶片的长度之比均在0.67左右。

2.2 紫菀酮含量积累的时间和空间变化情况

由图3可知，紫菀植株各部位均有紫菀酮积累，但含量有明显差异。根系是紫菀酮积累的主要器官，含量最高可达0.32%，远高于根状茎、芦头和叶片中的含量。根状茎中有少量积累，含量达到了《中华人民共和国药典》中规定的标准，可用于入药，芦头和叶片中积累量较少。从取样时期看，出苗后形成的第1条根中即检测到了紫菀酮，含量为0.15%，表明紫菀酮可以在根部合成。合成含量在10月中下旬前呈上升趋势，随着气温降低，地上部开始枯萎，根系生长缓慢，紫菀酮含量有所下降，之后植株地上部完全干枯，到第2年春季返青前，紫菀酮含量不断增加;芦头中紫菀酮含量在地上部枯萎前不断增加，11月中下旬达到峰值后无明显变化，根状茎中紫菀酮含量从出苗到来年春季返青前不断积累增加;叶片中紫菀酮含量在9月中下旬前处于稳定增加阶段，之后呈下降趋势，差异明显;叶柄中紫菀酮含量在植株整个生长期无明显变化。

2.3 不同处理下紫菀酮含量的差异显著性分析

紫菀相同部位不同时期、相同时期不同部位的紫菀酮含量均有显著差异，把紫菀酮含量设为因变量，时期和部位当作2个不同处理，设为变量，对主体间效应进行检验，从表1可以看出，误差均方为0.002，表明数据结果可靠可信，基于α=0.05，P值（部位）为0.000，不同部位紫菀酮含量差异极显著，P值（时期）为0.041，不同时期紫菀酮含量差异显著。

2.4 不同部位、不同时期紫菀酮含量的显著差异分析

把紫菀酮含量设为因变量，把部位设为变量，对不同部位紫菀酮含量进行显著差异分析，结果见表2，基于α=0.05，标准误差为0.02，叶柄与芦头无显著差异，叶柄与根状茎、叶片、根部差异显著;芦头与根状茎、叶片无显著差异，与根部差异显著;根状茎与叶片无显著差异，与根部差异显著;叶片与根部差异显著。

把紫菀酮含量设为因变量，时期设为变量，对不同时期紫菀酮含量进行显著差异分析，结果见表3，基于α=0.05，标准误差为0.02，A1、A2、A3、A4等4个时期无显著差异，可以归为类别Ⅰ，A5、A7、A8、A9等4个时期无显著差异，可以归为类别Ⅱ，A6与其余8个时期差异显著，A6归为类别Ⅲ，3个类别间差异显著，类别内差异不显著。

2.5 未抽薹植株与抽薹植株中紫菀酮含量动态变化情况

紫菀采用芦头为材料播种后，当年即可抽薹开花。由图4可知未抽薹紫菀各部位不同时期平均紫菀酮含量大多高于抽薹紫菀。就根系而言，植株生长的前2个月，紫菀酮含量均呈上升趋势，到第3个月芦头来源的植株中含量迅速下降，明显低于抽薹植株，至10月抽薹植株中紫菀酮含量开始上升。因此，未抽薹植株根中紫菀酮含量随植株生长发育呈现持续上升的状态，而抽薹植株紫菀酮含量则是呈升—降—升的趋势，二者在春季紫菀酮含量均下降，但前者最终含量高于后者。芦头和叶片中紫菀酮含量变化趋势基本相同。

2.6 未抽薹植株与抽薹植株不同处理下紫菀酮含量差异显著性分析

把紫菀酮含量设为因变量，时期和部位当作2个不同处理，设为变量，对主体间效应进行检验，从表4可以看出，误差均方为0.002，表明数据结果可靠可信，基于α=0.05，P值（部位）为0.000，差异极显著，P值（时期）为0.708，大于0.05，无显著差异，说明抽薹植株和未抽薹植株紫菀酮含量与时期相关性低，不同时期抽薹紫菀酮含量均低于未抽薹植株。

2.7 未抽薹植株与抽薹植株不同部位紫菀酮含量差异显著性分析

把紫菀酮含量设为因变量，把部位设为变量，对不同部位紫菀酮含量进行显著差异分析，结果见表5，基于α=0.05，标准误差为0.02，芦头（抽薹）、芦头（未抽薹）、叶片（抽薹）、叶片（未抽薹）无显著差异，可以归为类别Ⅰ，表明芦头和叶片中紫菀酮含量不受植株抽薹影响，相关性低;类别Ⅰ与根部（抽薹）、根部（未抽薹）差异显著，表明抽薹植株与未抽薹植株芦头与叶片中紫菀酮含量均与根部紫菀酮含量差异显著;根部（抽薹）与根部（未抽薹）紫菀酮含量差异显著，表明植株抽薹会影响植株根部紫菀酮含量积累，相关性高。

3 讨论与结论

中药紫菀是菊科植物紫菀的干燥根及根茎[5]。紫菀酮是紫菀中特有的三萜类化合物。关于紫菀酮积累的部位和时期差异，夏成凯等研究指出紫菀根中紫苑酮含量高于母根和根茎[6];郭伟娜等研究指出紫菀酮积累主要部位为韧皮部和皮层内侧，且根下部紫菀酮含量高于上部[7]，紫菀酮含量与根和根茎的质量比显著正相关[8]。本研究测定了不同时期根、芦头、根状茎、叶片、叶柄中紫菀酮含量，通过差异比较分析发现紫菀酮含量在不同部位、不同时期均呈显著差异，根部与其他4个部位紫菀酮含量差异显著，A6与其余8个时期紫菀酮含量差异显著，根部与10月分别为紫菀酮合成重点部位和重点时期;不同部位紫菀酮含量表现为根>根状茎>芦头>叶片>叶柄，10月中下旬前，根中紫菀酮含量不断增长，之后由于温度降低，紫菀酮含量显著减少，土冻后地上部完全干枯，地下部停止生长，但紫菀酮不断积累，次年3月春季返青前紫菀酮含量仍低于头年10月中下旬紫菀酮含量，根状茎中紫菀酮含量不断积累增加;芦头内紫菀酮含量在地上枯萎前不断积累，之后停止积累;值得关注的是，地上部停止生长，叶片开始变黄前，叶片中紫菀酮含量不断积累并达到峰值0.20%后不断减少;叶柄参与紫菀酮由地上部到地下部的运输，叶柄中紫菀酮含量在各个时期基本保持不变。计算不同时期新生叶叶柄长与叶片长比值，发现前期新生叶叶柄长大于叶片长，叶柄长与叶片长比值大于1，后期新叶叶柄长与叶片长比值不断减小，更有利于紫菀酮的运输。

抽薹主要是由于节间伸长进入生殖生长的丛生型植物的茎，受到温度和日光长度等环境变化的刺激，随着花芽的分化，茎开始迅速伸长，植株开始变高。二年生紫菀和以带芦头栽种的紫菀多会出现抽薹开花现象，当归、防风、天麻等中药材发育中也会出现早期抽薹现象，当归早期抽薹影响植株正常生长，抽薹前后，植株体内多个重要生理生化指标及次生代谢物阿魏酸和多糖差异显著，且大大降低挥发油的合成，增加根部柴性，最终导致当归失去其药用价值[9-10]，栽培防风由于内源激素量的变化在第2年或者第3年会出现大量抽薹，抽薹开花后，植株早期根部会出现中空、木质化，后期植株根部腐烂，色原酮及多糖含量大大降低，药效也大大降低，最终导致植株失去其药用价值[11-12]。本研究发现抽薹植株与未抽薹植株不同部位紫苑酮含量差异明显，除A1时期外，抽薹紫菀中根部紫菀酮含量均低于未抽薹植株;未抽薹紫苑根部紫苑酮含量变化趋势为高—低—高，抽薹紫苑变化趋势为高—低—高—低—高。3月底到7月中旬，植株不断生长，叶片增多，芦头、根状茎形成并增大，根系增多增长，此时营养物质主要供给植株生长发育，7月底到8月底是紫菀酮合成积累的重要阶段，未抽薹植株中营养物质主要用于次生代谢物的合成和积累，但此阶段抽薹植株进入盛花期，生殖生长阶段根中次生物质转化合成能力减弱，紫菀酮含量显著低于未抽薹植株。因此防止紫菀抽薹是保证紫菀品质与质量的前提。

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