用电压钳检测烟碱型乙酰胆碱受体导电孔道的重要位点

薛奋勤，李 华，刘丽娜，许 晴，薛 冰，魏 华

(首都医科大学 中心实验室, 北京 100069)

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)属于配体门控离子通道中半胱氨酸环受体家族的一员，广泛分布于哺乳动物的大脑中。其中α7 nAChR是中枢神经系统中的一个主要受体,对钙离子有很高的通透性[1]，在兴奋性突触传递、递质释放和神经突生长等神经元活动中发挥着重要作用[1-2]。

α7 nAChR由5个相同亚基组成,每个亚基均有一个胞外结构域(N端)，4个跨膜区段(M1-M4)和1个胞内环。每个亚基的跨膜区段M2借助于疏水作用力参与了受体导电孔道的形成。神经递质或激动剂与结合位点结合后会诱导受体构象变化，该变化传播到跨膜区段进而将孔道打开[3]；但是随着受体长时间与神经递质的结合，导电孔道又会关闭，即所谓的脱敏，脱敏会调控突触的传递过程[4]。所以研究α7 nAChR导电孔道的主要控制位点对于解析通道的激活机理及突触传递有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性非洲爪蟾(杭州爪蟾资源中心)；人α7 nAChR亚基的cDNA及卵母细胞表达的载体pGEMHE(本实验室保存)；基因定点突变试剂盒(Stratagene公司)；麻醉剂MS-222(Sigma-Aldrich公司)；其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR亚基结构模型的构建及跨膜区段M2的位置：以蛋白质数据库(Protein Data Bank)中电鱼(torpedo)的烟碱受体(代码为2BG9)A链为基准，采用Discovery Studio软件先将α7 nAChR亚基与之进行序列比对，然后以A链为模板由软件构建α7 nAChR亚基的三维结构模型。用Pymol软件显示α7 nAChR亚基的结构模型并展示其跨膜区段M2的位置。

1.2.2 测定α7 nAChR亚基的M2各个突变体对ACh的敏感性：基于PCR的定点突变方法将编码人α7 nAChR亚基M2区段的所有氨基酸(Leu248-Ala258)逐个突变成亲水性氨基酸丝氨酸，然后通过cDNA质粒体外转录的方法，以表达α7 nAChR亚基M2突变体制备cRNA，再将cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞中以表达α7nAChR亚基M2突变体，注射1～3 d后，室温下(22 ℃)用双电极电压钳记录卵母细胞膜电流。详情参考文献[5-6]。

用系列浓度的乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)灌流已注射cRNA的卵母细胞，测定其膜电流值，计算受体及突变体对ACh的半效应浓度值(median effective concentration,EC50)，通过对EC50的比较，分析各突变体对ACh的敏感性差异。

1.2.3 测定α7 nAChR亚基的M2突变体对ACh的脱敏程度: 与野生型(wild type，WT)相比,将对ACh敏感性显著降低的突变体cRNA注射到爪蟾卵母细胞中，注射1～3 d后用饱和浓度的ACh刺激并记录卵母细胞膜电流，对突变体的脱敏曲线进行拟合，得到各突变体脱敏的时间常数(τ值)。

1.2.4 α7 nAChR亚基的M2突变体对ACh的敏感性与脱敏程度的相关性分析:将α7 nAChR亚基的M2突变体对ACh的EC50和脱敏τ值的1/τ取对数，对log(EC50)和log(1/τ)进行线性回归分析，研究突变体对ACh的敏感性和脱敏程度的相关性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 α7 nAChR亚基结构模型的构建及跨膜区段M2的位置

α7 nAChR亚基主要由胞外结构域(N端)、偶联区、4个跨膜区段(M1-M4)，以及位于跨膜区段M3和M4之间的胞内环组成(图1)。其中跨膜区段M2借助于疏水作用力参与了受体导电孔道的形成。

A.structure of α7 nAChR subunit and its related domains；B.transmembrane region M2 of α7 nAChR subunit is involved in the formation of ion-conducting pore of the receptor by the hydrophobic force图1 α7 nAChR三维结构模型及跨膜区段M2的位置Fig 1 Location of the transmembrane segment M2 in the three-dimensional structural model of α7 nAChR

2.2 测定α7 nAChR亚基的M2各个突变体对ACh的敏感性

α7 nAChR亚基跨膜区段M2的突变体L248S、V252S、L255S和L256S对ACh的EC50值减少得最多，超过20倍(表1)。与WT相比，4个亲水性突变导致剂量-反应曲线向左显著移动(图2)。

图2 α7 nAChR野生型及其突变体对乙酰胆碱的剂量-反应曲线Fig 2 Dose-response curve of wild type and its mutantsof α7 nAChR against the agonist acetylcholine

表1 用双电极电压钳测定各突变体的EC50值

2.3 测定α7 nAChR亚基的M2各个突变体对ACh的脱敏程度

M2区的4个突变体(L248S、V252S、L255S和L256S)在爪蟾卵母细胞表达后，用饱和浓度的ACh来刺激这些突变体。结果显示，与WT相比，4个突变体的脱敏程度均显著降低(图3)。

τ(WT)=0.17±0.04 s, n=6；τ(L248S)=180.00±5.28 s and τ(V252S)=300.00±12.65 s, n=4, P<0.001; τ(L255S)=8.09±0.47 s and τ(L256S)=6.98±0.71 s, n=4, P<0.01

2.4 α7 nAChR亚基的M2各个突变体对ACh敏感性与脱敏程度的相关性分析

M2区突变体对ACh敏感性和脱敏程度呈正相关性(图4)。

图4 α7 nAChR野生型和突变体对乙酰胆碱的敏感性与脱敏程度相关性Fig 4 Sensitivity of wild type α7 nAChR and its mutants to acetylcholine was positively correlated with the degree of desensitization(R2=0.98)

3 讨论

在本研究中，采用定点突变和双电极电压钳的方法，检测了组成人α7 nAChR导电孔道的主要氨基酸位点。研究发现，当对位于该受体M2跨膜区段的4个位点(L248、V252、L255和L256)进行亲水性突变后，它们对激动剂ACh的敏感性提高， 即增加了离子通道受体的开放概率。同时还发现，这4个亲水性突变体对ACh的脱敏程度降低，即这些离子突变体的离子通道一旦打开便不易关闭。综上，这些结果表明位于M2跨膜区段的L248、V252、L255和L256位点对于离子通道的开放起着决定性作用，是组成α7 nAChR受体导电孔道的主要氨基酸位点。

乙酰胆碱受体包括毒蕈碱型乙酰胆碱受体和烟碱型乙酰胆碱受体，它在中枢和外周神经系统中均发挥着重要作用。其中，α7 nAChR是由5个相同亚基组成的五聚体，对钙离子的通透性高，对钙离子的浓度调控及神经递质的释放起着重要作用[7]。α7 nAChR与阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症及癫痫等发病有着十分密切的联系[4]。

nAChR的激活过程涉及到受体的多个结构域。当激动剂结合到位于nAChR胞外端的结合位点后，该区域即发生构象变化。随后，这些构象变化要通过处于胞外端和跨膜区段的耦合区段才能传递到导电孔道，从而使通道打开。在这个过程中，多个结构域，包括胞外端、loop7、loop2、M1和M2-M3连接区段及导电孔道等，都参与了构象变化的传递，最终使受体通道激活[8]。

目前，nAChR激活的结构学机理还不完全清楚。尽管前人的研究表明在受体通道的激活过程中多个结构域发生了构象变化，但是构象变化怎样从胞外端传递到导电孔道还不完全清楚。其中一个基本的问题是在构象发生变化的结构域中哪些氨基酸起着重要作用[9]。在本研究中，通过定点突变和双电极电压钳的方法，发现位于受体M2跨膜区段的L248、V252、L256和L255是组成α7 nAChR导电孔道的主要氨基酸位点。该研究对于研究nAChR的激活及脱敏的结构学机理起着重要的基础作用。