核桃低聚肽对急性溃疡性结肠炎小鼠的改善作用

张亭 刘睿 珠娜 郝云涛 康家伟 胡佳妮 毛瑞雪 刘欣然 李勇

摘 要：目的：探讨核桃低聚肽（WOPs）对急性溃疡性结肠炎小鼠的改善作用。方法：成年雄性BALB/C小鼠按体重随机分为6组，空白对照组、模型对照组和3个WOPs剂量组（220、440、880 mg/kg BW），每组10只。小鼠饮用5%DSS构建急性溃疡性结肠炎模型，灌胃给予相应受试物7 d，每日观察测量DAI。7 d后，处死小鼠测量结肠外观形态及长度变化、CMDI，血清DAO、D-LA含量，结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MPO含量，并进行结肠组织病理学观察。结果：WOPs能显著减少血清DAO和D-LA含量，降低DAI评分、结肠组织MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，提高IL-10水平，明显增加结肠长度，降低CMDI。此外，WOPs还可以恢复DSS所致的结肠黏膜炎症损伤。结论：WOPs对经DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有改善作用，其机制可能与调整机体内促炎因子与抗炎因子含量有关。

关键词：核桃低聚肽;急性溃疡性结肠炎;小鼠

目前临床药物治疗溃疡性结肠炎均存在一定的不良反应，因此，寻找天然安全有效的化学物治疗急性溃疡性结肠炎显得尤为重要。我国核桃资源非常富足，研究表明，核桃在改善学习记忆[1]、预防心脑血管疾病[2]、糖尿病[3]、调节体重[4]、抗癌[5]等方面均具有一定的作用。低聚肽是氨基酸的低聚物，在体内可不经消化直接吸收，能够明显降低肠道消化以及废物排出负担[6]。本研究采用DSS构建急性溃疡性结肠炎小鼠模型，通过疾病活动指数（DAI）、结肠黏膜损伤指数（CMDI）、病理变化、血清炎症反应指标以及结肠组织炎症因子等含量的测定，探讨核桃低聚肽（WOPs）对急性溃疡性结肠炎小鼠的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级成年雄性BALB/c小鼠，体重18～22 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0010;使用许可证号：SYXK（京）2016-0041。分笼饲养，每笼5只，自由饮食、饮水。动物饲养实验室温度为（25±1）℃，相对湿度为50%～60%，昼夜周期节律控制在12 h/12 h。

1.2 主要试剂与仪器

WOPs，北京天肽生物科技有限公司;葡聚糖硫酸钠（DSS）、粪便潜血试剂盒，北京爱特蒙科技有限公司;DAO、D-LA、MPO、TNF-α、IL-6、IL-10等ELASA试剂盒，北京泰格诺克科技有限公司。

1.3 分组与处理

小鼠按体重随机分为6组，空白对照组、模型对照组和3个WOPs剂量组（220、440、880 mg/kg BW），每组10只。小鼠自由饮用5%DSS 7 d，每隔1 d更换新鲜的DSS溶液。空白对照组用饮用蒸馏水。造模第1天开始灌胃给药，除空白对照组与模型对照组给予蒸馏水外，其余各组以0.1 mL/10 g体重给予相应受试物7 d。

1.4 指標

1.4.1 DAI评分 每日称量小鼠体重，观察大便性状和便血情况，并按以下评分标准[7]进行评分，将体重下降、大便性状和便血情况评分均值作为DAI（表1）。大便潜血按照粪便潜血试剂盒使用说明操作。

1.4.2 结肠外观形态及长度变化 迅速剖开腹腔，游离结肠和远端回肠，取出肛门至盲肠末端整个肠段，观察各组结肠外观形态改变、测量肛门至盲肠末端的整个肠段长度。

1.4.3 结肠黏膜损伤指数评分 沿肠系膜剪开结肠，用预冷无菌生理盐水漂洗干净结肠，清除结肠黏膜表面黏附的粪便、分泌物及血液。将结肠平铺于冰盒上，肉眼观察，CMDI评分参照Luketal标准进行[8]：0分为结肠无损伤;1分为结肠轻度水肿但没有溃疡;2分为充血且肠黏膜粗糙呈颗粒状;3分为结肠黏膜溃疡形成，直径约0～1 cm;4分为结肠黏膜溃疡形成，直径约1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连;5分为溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。

1.4.4 血清D-LA及DAO的检测 血清D-LA及DAO含量测定按照ELISA试剂盒的操作说明进行，每个样品设定2个复孔，通过标准曲线计算样品含量，结果取平均值进行统计分析。

1.4.5 结肠组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及MPO的检测 结肠炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MPO含量测定方法按照ELISA试剂盒中操作说明进行。

1.4.6 结肠组织病理学观察 在结肠远端炎症反应明显处取长约2 cm的结肠组织置于10%福尔马林浸泡固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.5 统计方法

实验结果用均数±标准差（±SD）表示。SPSS 22.0软件进行统计分析，小鼠血清DAO、D-LA含量及结肠炎症因子采用单因素方差分析;其他数据方差齐采用单因素方差分析，方差不齐者采用非参数检验。实验组与对照组两两组间比较采用最小显著差异法，以P<0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 WOPs对DSS诱导小鼠DAI评分的影响

从表2可以看出，模型组小鼠DAI评分明显升高（P<0.01），表明经DSS诱导的小鼠体重、肠道均受到不同程度的影响。与模型对照组相比，WOPs各剂量组小鼠DAI评分明显降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.2 WOPs对DSS诱导小鼠D-LA和DAO的影响

如表3所示，模型对照组小鼠血清D-LA和DAO含量较空白对照组显著增加（P<0.01、P<0.01），表明经DSS诱导后，肠道黏膜上皮细胞出现不同程度损伤，肠道黏膜通透性增加。与模型对照组相比，WOPs各剂量组小鼠血清D-LA含量均明显降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;WOPs各剂量组小鼠血清DAO含量均有所降低，其中WOPs中、高剂量组降低明显（P<0.05、P<0.01）。

2.3 WOPs对DSS诱导小鼠结肠炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的影响

如表4所示，模型对照组结肠组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量较空白对照组均显著增加（P<0.01、P<0.01、P<0.01），IL-10含量明显减少（P<0.01）。与模型对照组相比，WOPs各剂量组结肠组织IL-1β、IL-6均显著降低（P<0.01、P<0.01），IL-10含量显著增加（P<0.01）;各组TNF-α水平均有所下降，其中WOPs高剂量组下降明显（P<0.05）。

2.4 WOPs对DSS诱导小鼠结肠MPO的影响

如表5所示，模型对照组小鼠结肠组织MPO含量较空白对照组显著增加（P<0.01），表明经DSS诱导的小鼠结肠组织中性粒细胞浸润的数量增多，程度加深。与模型对照组相比，WOPs各剂量组小鼠血清MPO含量均有所降低，其中WOPs中、高剂量组降低较为显著（P<0.05、P<0.01）。

2.5 WOPs对DSS诱导小鼠结肠外观、形态和长度的影响

模型组小鼠结肠充血、水肿严重，呈现暗红色。WOPs各剂量组上述现象缓解。如表6所示，模型对照组小鼠结肠长度较空白对照组明显降低。与模型对照组相比，WOPs各剂量组小鼠结肠长度均显著增加（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.6 WOPs对DSS诱导小鼠CMDI的影响

如表7所示，模型对照组CMDI明显高于空白对照组（P<0.01）。与模型对照组相比，WOPs高剂量组小鼠CMDI明显降低（P<0.01）。

2.7 WOPs对DSS诱导小鼠结肠黏膜病理的影响

附图为结肠组织病理切片HE染色后光学显微镜下观察的结果。空白对照组中，基本无炎性细胞浸润（附图a）。与空白对照组相比，模型对照组镜下出现大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主。结肠炎症破坏肠壁，严重者侵犯至浆膜层。此外，该组结肠组织出现杯状细胞的缺失（附图b）。与模型对照组相比，WOPs低剂量组仍有部分炎性细胞浸润，但均已局限在黏膜层（附图c）。WOPs中、高剂量组结肠组织炎性细胞浸润减少明显，且随着WOPs剂量的增加，结肠杯状细胞逐渐变为正常（附图d、e），表明WOPs能够改善结肠炎症细胞浸润所致的组织损伤，具有一定的恢復作用。

3 结论

综上所述，WOPs对急性溃疡性结肠炎小鼠具有明显的改善作用，其机制可能与调节小鼠结肠内抗炎因子与促炎因子平衡有关。

4 讨论

研究表明，WOPs干预后，经DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠状态有所好转，且DAI和CMDI评分明显降低，表明WOPs对溃疡性结肠炎小鼠疾病状态有显著的改善作用。模型小鼠经DSS诱导后结肠TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高，IL-10水平明显降低。TNF-α由巨噬细胞产生，属于促炎因子，它也是其他促炎因子的重要启动因子，具有启动、放大和延续全身或局部的炎症反应的作用。TNF-α可刺激机体产生IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子，而这些炎性因子与UC结肠黏膜炎症发生发展关系十分密切[9-10]。此外，TNF-α可诱导结肠上皮细胞凋亡，导致上皮通透性增加。同时可通过刺激单核细胞和巨噬细胞增殖分化，大量释放炎症介质，破坏周边临近肠道黏膜，扩大溃疡面范围。IL-6可改变结肠细胞电解质分泌状态，增加结肠内皮细胞通透性，导致中性粒细胞大量浸润，加重炎症反应。此外，IL-6的高含量状态可使Jak/STAT3通路异常激活，导致UC炎症级联反应发生，进一步加重炎症反应[11-12]。IL-10在天然免疫过程中是重要的负调节因子，可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-lβ等促炎因子表达，且不影响抗炎介质表达[13]。WOPs处理后，促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达降低，抗炎因子IL-10的表达升高，表明WOPs可通过提高抗炎因子水平、降低促炎因子水平抑制结肠组织炎症反应。

本研究结果显示，经DSS诱导的模型小鼠血清中DAO、D-LA和结肠组织MPO水平明显增加，表明模型组小鼠黏膜受到明显损伤。DAO是肠道黏膜上皮细胞中的细胞内酶，当肠道黏膜上皮细胞损伤时DAO释放入血，因而血清DAO升高可间接反映肠道黏膜上皮细胞损伤程度[14]。D-LA是细菌发酵代谢产物，可通过受损黏膜入血导致血清D-LA水平升高，因此血清D-LA水平可间接反映肠道黏膜通透性变化。MPO主要由中性粒细胞分泌，组织中MPO活性变化可间接反映组织中性粒细胞浸润的数量及程度[15]。经WOPs处理后，DAO、D-LA、MPO含量明显降低，表明WOPs能一定程度上修复黏膜上皮损伤。对小肠绒毛观察发现，经DSS诱导的模型小鼠镜下出现大量以中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。结肠炎症破坏肠壁，结肠组织出现杯状细胞的缺失。经WOPs处理后，小鼠结肠组织炎性细胞浸润减少明显，且随着WOPs剂量的增加，结肠杯状细胞逐渐变为正常，表明WOPs能够改善结肠炎症细胞浸润所致的组织损伤，具有一定的恢复作用。

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