基于SBSE-GC-MS的紫芽茶挥发性成分分析

田军 吕海鹏 马婉君 石亚丽 林智

摘要：采用搅拌棒吸附萃取（SBSE）技术结合气相色谱质谱联用（GC-MS）分析了6个代表性紫芽茶中的挥发性成分。结果表明，紫芽茶中具有丰富的挥发性成分，化合物种类和数目高于对照绿茶;芳樟醇、香叶醇、α-松油醇、α-紫罗酮、β-紫罗酮、（E， E）-2， 4-庚二烯醛、水杨酸甲酯、邻甲氨基苯甲酸甲酯、二氢猕猴桃内酯和对乙酰氨基苯酚等化合物是紫芽茶中含量最丰富的香气成分。相对气味活性值（ROAV）分析表明，β-大马士酮、β-紫罗酮、反式-2，4-癸二烯醛、2-己烯醛、α-紫罗酮和芳樟醇等6种香气成分可能是紫芽茶中一些关键的致香成分;另外，1-辛烯-3-醇、二氢猕猴桃内酯、正己醛、正癸醛、β-环高柠檬醛、反式-2-壬醛、正庚醛、β-环柠檬醛和正辛醛等9种成分可能对紫芽茶的整体香气具有重要的修饰作用。

关键词：紫芽茶;挥发性分析;搅拌棒吸附萃取-气相色谱质谱联用;相对气味活性值

Volatile Compounds of Purple

Teas Based on SBSE-GC-MS

TIAN Jun1，  LÜ Haipeng2， MA Wanjun2，3， SHI Yali2，3， LIN Zhi2

1. Kunming Colourful Yunnan King-shine Tea Industry Co.， Ltd.， Kunming 650000， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China

Abstract： Volatile components of six typical purple teas were analyzed by stir bar sorptive extraction （SBSE） combinedwith gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Results show that purple teas were rich in volatile components， whose abundance and contents were much higher than those in the green tea. Volatile compounds including linalool， geraniol， α-terpineol， α-ionone， β-ionone， （E， E）-2， 4-heptadienal， methyl salicylate， methyl methanthranilate， dihydroactinidiolide and acetaminophen were the most abundant ones in purple teas. Results of ROAV analysis show thatthe aroma components， such as β-damascenone， β-ionone， （E， E）-2， 4-decadienal， 2-hexenal， α-ionone and linalool， might be the key aroma components in purple teas. Besides， nine components， including 1-octene-3-ol， dihydroactinidiolide， hexanal， decanal， β-cyclohomocitral， trans-2-nonanal， heptanal， β-cyclocitral and octanal， might have important modification effects on the overall aroma of purple teas.

Keywords： purple tea， volatile compounds， SBSE-GC-MS， ROAV

茶樹为多年生常绿植物，其叶片通常为黄绿色，但在基因和环境条件的改变下，叶片颜色可发生紫色突变[1]，研究发现花青素的含量与芽叶紫色的深浅一般呈现正相关关系[2]。叶色特异茶树品种具有开发特色或健康茶产品的前景，引起了人们的广泛关注。日本、斯里兰卡、肯尼亚和印度等国的科研人员已经针对紫化茶开展了大量的研发工作。我国紫芽茶茶树品种的选育始于20世纪80年代中期，目前选育的特异品种主要有紫娟、红芽佛手、苔香紫及紫嫣等[3]。紫芽茶的香气品质一般比较特殊，例如，紫娟绿茶香气特殊，红茶香型高雅;紫嫣烘青绿茶有嫩香，红茶香气浓郁、有甜香[4];再如，紫娟绿茶特别是晒青茶滋味带有特殊的辛辣味[5]。以往关于紫芽茶化学成分的研究主要集中在其非挥发性成分方面，已经查明了紫芽茶中的花青素、多酚、儿茶素、氨基酸、黄酮、咖啡碱等品质化学成分的含量水平等[6-9]。然而，目前在紫芽茶挥发性成分方面的研究报道较少，限制了人们对紫芽茶香气品质的科学认知。

茶香实际上是不同的芳香物质通过不同浓度组合，并对嗅觉神经综合作用所形成的茶叶特有的香型。紫芽茶香气成分的研究对查明其特殊茶香的化学本质和提升紫芽茶加工技术具有重要价值。以往在紫芽茶香气成分分析方面，研究人员采用的香气成分富集方式主要有同时蒸馏萃取（Simultaneous distillation extraction，SDE）法[10]和固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）法等[11]。近年来，搅拌棒吸附萃取（Stir bar sorptive extraction，SBSE）法作为一种新型的样品前处理技术具有独特的优势，引起了人们的关注[12]。SBSE是一种环境友好型的萃取技术，具有良好的重复性，且能够降低样品分析的检测限;其搅拌棒上的涂层吸附量是SPME的50～250倍，富集倍数较SPME高。因此，本研究拟采用SBSE-GC-MS技术查明紫芽茶中挥发性成分的组成特点，以期为揭示紫芽茶香气品质物质基础提供依据。

一、材料与方法

1. 试验材料

试验材料为近年来收集于江苏省、浙江省、四川省、云南省等地的12个紫芽茶产品，基本都是用一芽二叶制备的烘青绿茶样品。对这12个样品进行感官审评，主要侧重香气感官品质差异，从中筛选出6个具有代表性的紫芽茶烘青绿茶样品作为研究对象。这6个样品包含紫娟烘青绿茶1个，编号为ZJ-1;其他5个紫芽茶烘青样品编号为ZY2 ～ ZY6;另外设置中茶108茶树鲜叶制备的烘青绿茶样品作为对照（CK）。

2. 挥发性成分的SBSE-GC-MS分析方法

（1）挥发性成分的富集方法

采用搅拌棒吸附（SBSE）方法，称取600 mg茶粉与500 mg NaCl同置于顶空瓶中，加入10 mL沸水冲泡，放入PDMS转子平衡1 min后置于磁力搅拌器上吸附30 min（1 200 r/min，80 ℃）[12]。

（2）挥发性成分的鉴定方法

采用6890-5975 GC-MS联用仪，色谱条件：选用HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm），美国Agilent公司;升温程序：50 ℃ 保持2 min，以4 ℃/min的速率升温至170 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升至265 ℃，保持5 min，总共运行时长51.5 min。质谱条件：电子电离源;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;质谱扫描模式为全扫描，质量扫描范围33～600 u。

（3）挥发性成分的定性定量方法

将样品原始数据导入色谱软件，经过预处理后，通过谱库检索（nist，mainlib，replib等数据库）匹配化合物信息，并通过比对化合物保留指数试验值与参考值验证，以各香气组分的峰面积占总峰面积之比值表示组分相对含量（%）。

3. 关键呈香成分的鉴定方法

在相对定量的基础上，查阅各香气化合物在水中的阈值，参考马士成等[13]的研究方法，按下式计算各香气成分的相对气味活性值ROAV：

式中：Ci为茶叶中香气组分i的相对含量（%）;Ti为组分i在水中的香气阈值（μg/kg）;Cmax与Tmax分别表示对样品总体风味贡献最大的组分的相对含量（%）和香气阈值（μg/kg）。ROAV≥1的组分被确定为茶叶中的活性香气化合物，0.1≤ROAV<1的组分被认为对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

二、结果与分析

1. 紫芽茶样品中的挥发性成分分析

对6个紫芽茶和1个绿茶进行挥发性成分分析，其中1个代表性紫芽茶样品和绿茶对照样挥发性成分的SBSE/GC-MS总离子流图分别如图1和图2。研究表明，在紫芽茶中鉴定出的挥发性成分的数量明显高于对照绿茶。在6个紫芽茶样品中通过谱库检索以及保留指数对比分析，共鉴定出了66种挥发性香气成分，而在对照绿茶样品中共鉴定出54种挥发性成分（表1）。与该研究结果类似，姜东华等[11]采用HS-SPME-GC-MS分析发現，紫娟晒青茶和紫娟烘青茶香气成分较接近，但比大叶种茶丰富且差异较大;此外，夏丽飞等[10]采用SDE-GC-MS法分析发现，紫娟茶香气物质较大叶种茶丰富且成分差异较大，紫娟茶中分离出大叶种茶未检出的化合物有21种。可见，尽管不同研究中采用的香气萃取富集方式不同，但研究结果都表明紫芽茶比一般绿茶具有更加丰富的挥发性成分。

根据挥发性成分化学结构等方面的差异，它们可以分为醇类、酮类、醛类、酯类、内酯类、碳氢化合物、酚类以及杂氧类化合物等。紫芽茶与绿茶对照中主要香气成分及其相对含量如表1，醇类成分是紫芽茶中含量最丰富的成分，6个样品中醇类成分的相对含量都超过30%，其中在ZY-2中相对含量最高，为50.10%;其次为紫娟绿茶ZJ-1，为42.23%。另外，紫芽茶醇类成分中，含量最丰富的香气成分为芳樟醇，其次为二氢芳樟醇、芳樟醇氧化物、香叶醇、α-松油醇以及植醇等。芳樟醇是茶叶中重要的香气成分[14]，具有显著花香。芳樟醇含量在紫芽茶中占比最高，一般都超过8%，尤其是在ZY-2中相对含量高达24%以上。二氢芳樟醇是紫娟晒青茶中的主要香气成分之一[15]，具有新鲜木香伴有柑橘气息。3种芳樟醇氧化物的含量在紫芽茶中均明显高于对照绿茶，可能与芳樟醇以及芳樟醇的前体糖苷类物质含量水平在紫芽茶中较高有关，也有可能与紫芽茶中芳樟醇系列化合物转化酶的活力水平较高有关。具有花香、木香、烘烤香的芳樟醇系列化合物在紫芽茶中含量占比相对较高，可能是紫芽茶中主要香气特征成分。香叶醇一般表现为甜花香、果甜香，阈值为20 μg/kg，其在紫芽茶中也具有较高的相对含量（>3%）。α-松油醇具有松树、丁香花香，阈值为350 μg/kg，其相对含量水平在紫芽茶中一般可到2%左右。另外，植醇在紫芽茶中也具有较高的相对含量，它具有清香、草香的呈香特性。与紫芽茶样品相比，对照绿茶样品中含量丰富的香气成分为芳樟醇、香叶醇、α-松油醇和芳樟醇氧化物等。

6个紫芽茶中酮类成分的含量介于9.66%～18.40%之间;其中含量丰富的成分为β-紫罗酮、α-紫罗酮以及异佛尔酮等。β-紫罗酮具有甘甜醇厚的花香，并伴有微弱的木香气息，阈值为0.09 μg/kg，在紫芽茶中平均含量为8.60%;α-紫罗酮具有紫罗兰花香，阈值为0.4 μg/kg，在紫芽茶中平均含量为1.48%，其中在ZY-5中含量占比最高（2.21%）。与紫芽茶样品相比，对照绿茶样品中酮类含量丰富的香气成分为β-紫罗酮，高达17.69%。

紫芽茶中醛类成分的平均含量为13.06%，其中（E， E）-2， 4-庚二烯醛和正己醛是含量最丰富的成分，它们的平均含量分别为4.68%和4.09%。（E， E）-2， 4-庚二烯醛具有瓜果的清香气息，阈值为56 μg/kg，在紫芽茶样品ZY-6（8.81%）及紫娟绿茶（7.83%）中含量较高。与紫芽茶样品相比，对照绿茶样品中醛类含量一般都偏低，含量较高的香气成分有（E， E）-2， 4-庚二烯醛（4.02%）和β-环柠檬醛（1.24%）等。醛类化合物中正己醛、正庚醛、正辛醛、正癸醛、苯乙醛和反式-2，4-癸二烯醛含量高于对照绿茶;这些具有青草香型特征的醛类化合物虽然含量占比不高，但可能也为紫芽茶贡献了主要的木质青草气息。

6个紫芽茶中也含有丰富的酯类成分，其相对含量介于12.26%～28.18%之间;其中邻甲氨基苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯等成分的含量较高。邻甲氨基苯甲酸甲酯具有花粉香、果甜香，在紫芽茶ZY-3中含量最高（16.14%）;水杨酸甲酯一般具有冬青油、薄荷香气，阈值为40 μg/kg，在紫芽茶ZY-4中含量较高（8.50%）。与紫芽茶样品相比，对照绿茶样品中酯类含量略高于紫芽茶的平均水平，其中邻甲氨基苯甲酸甲酯（12.17%）和邻苯二甲酸二乙酯（3.74%）的含量最高。此外，二氢猕猴桃内酯是在紫芽茶样品中检测到的唯一的内酯类化合物，其一般具有香豆素并伴有麝香气息，在紫芽茶中的平均含量为5.03%，低于对照绿茶样品中的含量（7.70%）。

6个紫芽茶中碳氢化合物的平均含量为5.80%，略高于对照绿茶样品（5.34%）。其中甲苯在紫芽茶和对照绿茶中的含量差异较大，分别为1.58%和0.79%。与对照绿茶相比，紫芽茶中的酚类挥发性成分的含量较低（3.74%）。酚类挥发性成分中，尽管对乙酰氨基苯酚在紫芽茶中检出含量较高（3.12%），但该化合物不具有气味属性，对茶叶香气一般不具有贡献作用。另外，一些杂氧化合物成分，例如2-戊基呋喃在紫芽茶中都能检测到，平均含量为0.15%，而在对照绿茶中未检测到。

总体而言，紫芽茶的挥发性成分以芳樟醇、香叶醇、α-松油醇、α-紫罗酮、β-紫罗酮、（E， E）-2， 4-庚二烯醛、水杨酸甲酯、邻甲氨基苯甲酸甲酯、二氢猕猴桃内酯和对乙酰氨基苯酚等化合物为主。虽然6个紫芽茶样品中的挥发性化合物含量组成存在一定差异，可能与其品种及烘青工艺不同有关，但整体而言紫芽茶与对照绿茶的挥发性成分差异更为明显。比较紫芽茶与对照绿茶的挥发性成分可以发现（图3），紫芽茶中醇类、醛类和杂氧类化合物含量水平要高于对照绿茶，而酮类、内酯类、酚类化合物含量水平低于对照绿茶，其他类型的挥发性成分的含量水平差异不明显。另外，有研究指出[15]，紫娟烘青茶香气成分的组成特点是以萜烯醇、脂肪醇和碳氢化合物含量较高，芳香醇和酮类含量次之，酸类含量最低。

2. 基于ROAV值的紫芽茶样品中关键香气成分分析

在食品中已累计鉴定出上万种挥发性化合物，但是这其中仅有一小部分化合物对食品风味具有显著贡献作用，即关键香气化合物。目前，可以通过化合物相对含量和阈值来计算相对气味活性值（ROAV）从而判断化合物对食品风味的贡献程度[16]，达到初步判断关键香气化合物的目的。

通过计算紫芽茶中主要挥发性化合物的ROAV值（表2），发现了6种对紫芽茶香气贡献显著（ROAV≥1）的化合物，分别为β-大马士酮（99.45）、β-紫罗酮（56.89）、反式-2，4-癸二烯醛（5.01）、2-己烯醛（3.22）、α-紫罗酮（2.14）和芳樟醇（1.30），推断这6种化合物对紫芽茶的香气品质具有显著贡献作用。具有苹果味、甜香气息的β-大马士酮虽然在紫芽茶中相对含量不高（0.40%），但因其气味阈值极低（0.002 μg/kg），较低浓度就能被人感知到气味，因此计算得到的ROAV值最高，对紫芽茶香气贡献最大;其次是具有甘甜醇厚花香气息的β-紫罗酮，同时具备高相对含量（8.60%）和低阈值（0.09 μg/kg）的特点，对紫芽茶香气品质贡献较为显著;具有黄瓜、甜瓜香的反式-2，4-癸二烯醛和具有青草香的2-己烯醛都属于清香型不饱和醛类化合物，可能对紫芽茶的清香起主要贡献作用;此外，具有紫罗兰花香的α-紫罗酮和具有铃兰花香的芳樟醇可能主要对紫芽茶贡献花香。

除了以上6种化合物之外，研究还发现有9个化合物可能对紫芽茶的香气品质具有重要修饰作用（0.1≤ROAV<1），即1-辛烯-3-醇（0.91）、二氢猕猴桃内酯（0.79）、正己醛（0.56）、正癸醛（0.36）、β-环高柠檬醛（0.26）、反式-2-壬醛（0.24）、正庚醛（0.19）、β-環柠檬醛（0.12）和正辛醛（0.11）。这些不同类型的化合物的香气特征差异较大，例如1-辛烯-3-醇具有蘑菇味，二氢猕猴桃内酯则具有香豆素、麝香气息，β-环柠檬醛具有烟草、酸味，而β-环高柠檬醛则表现出樟脑、凉木香，其余的醛类物质如正己醛、反式-2-壬醛、正庚醛均表现出类似的青草香，而正癸醛和正辛醛则表现出柑橘、橙花香等香气特征。这些化合物可能会与其他香气成分产生协同或拮抗作用，从而对紫芽茶整体香气品质起到修饰、协调的作用。

三、结论

本研究采用SBSE-GC-MS技术分析了6个代表性紫芽茶样品和1个绿茶对照样品的挥发性成分组成及含量差异情况等。研究表明，紫芽茶中具有丰富的挥发性成分，化合物种类和数目高于对照绿茶。紫芽茶中醇类、醛类和杂氧类化合物含量水平要高于对照绿茶，而酮类、内酯类、酚类化合物含量水平低于对照绿茶;芳樟醇、香叶醇、α-松油醇、α-紫罗酮、β-紫罗酮、（E， E）-2， 4-庚二烯醛、水杨酸甲酯、邻甲氨基苯甲酸甲酯、二氢猕猴桃内酯和对乙酰氨基苯酚等化合物是紫芽茶中含量最丰富的香气成分。ROAV值分析表明，β-大马士酮、β-紫罗酮、反式-2，4-癸二烯醛、2-己烯醛、α-紫罗酮和芳樟醇等香气成分可能是紫芽茶中一些关键的致香成分，另外，1-辛烯-3-醇、二氢猕猴桃内酯、正己醛、正癸醛、β-环高柠檬醛、反式-2-壬醛、正庚醛、β-环柠檬醛和正辛醛等9种成分可能对紫芽茶的整体香气具有重要的修饰作用。

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