多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究进展

邹纯 尹军峰

摘要：多酚氧化酶是茶叶加工中一类重要的氧化还原酶。文章归纳了多酚氧化酶的结构性质和酶学性质，重点阐述了其在红茶、绿茶、乌龙茶和黑茶加工中的研究现状，并展望了其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。

关键词：多酚氧化酶;茶叶加工;结构性质;酶学性质;应用

The Properties of Polyphenol Oxidase and Its

Research Progress in Tea Processing

ZOU Chun， YIN Junfeng*

Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China

Abstract： Polyphenol oxidase is an important oxidoreductase in tea processing. This paper summarized the structural and enzymatic properties of polyphenol oxidase， emphasized its research status in the processing of black tea， greentea， oolong tea and dark tea， and prospected its future research directions， in order to provide a reference for in-depthresearch and application of polyphenol oxidase.

Keywords： polyphenol oxidase， tea processing， structural properties， enzymatic properties， application

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）广泛存在于植物、动物、真菌体内，属于氧化还原酶，在广义上根据催化底物酚羟基数量的不同，可分为三大类[1]：单酚氧化酶（酪氨酸酶，EC 1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶，EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）。植物中的PPO主要是儿茶酚氧化酶，能够在有氧条件下催化多酚类物质生成对应的醌类。

PPO在茶叶加工中具有重要作用，通过不同加工工序或工艺抑制或提升PPO活性，可制备出风味迥异的各类茶。本文对多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究现状进行了综述，展望其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。

一、PPO的结构与性质

1. PPO的结构

（1）蛋白结构

植物PPO通常先以无活性的前体形式存在，其典型结构主要分为3个部分：N-末端转移肽、中间铜离子结合区、C-末端疏水区（图1）[2]。N-末端转移肽的大小通常为8～12 kDa，大部分为叶绿素转移肽，其作用是将PPO前体蛋白转运至叶绿体类囊体腔，在成熟的PPO中转移肽已被去除[3]。中间铜离子结合区是维持PPO催化活性所必须的，通常由CuA和CuB兩个铜离子活性中心组成，每个铜离子活性中心分别由1个铜离子和3个组氨酸残基以配位键相连，形成具有特定三维结构的活性部位。CuA和CuB结构域在不同植物种类中表现出高度保守性，但是CuB还具有一定的变异性，这种变异性可能造成不同PPO对底物的偏向性。C-末端疏水区有两个保守的结构域PPO1_PWL和PPO1_KFDV，其功能目前尚不明确，但是有研究者认为它可以通过遮挡酶活性中心的“催化口袋”来控制PPO的催化活力，切除该结构域可能对PPO起激活作用[4]。

研究发现，PPO在体外实验中可以被多种方式激活[5]：蛋白酶有限水解、酸或碱处理、加热处理、老化（失水）作用、强洗涤剂（SDS）或者醇处理。Nozue等[6]研究发现，在甘薯中存在两种不同亚型的PPO：分子量为40 ku的高活性PPO和分子量为60 ku的低活性PPO;在丝氨酸蛋白酶的作用下，低活性PPO可被水解为高活性形式。Gandia-Herrero等[7]通过SDS对甜菜根PPO前体酶进行体外激活，发现PPO前体酶在激活过程中活性中心没有受到SDS的影响，而是蛋白构象逐渐改变成利于疏水性底物进入。Kampatsikas等[8]研究发现，苹果PPO前体酶的C-末端结构域遮挡了其活性中心，影响其催化活性;而在C-末端结构域与活性中心之间的Lys355-Val370连接序列可发生自我断裂，将活性中心暴露，使底物更容易进入其活性中心，从而实现PPO的自我激活。由此可知，PPO酶蛋白结构和构象对其催化活性起决定作用。

（2）基因结构

植物PPO由核基因编码表达，在植物的光合组织以及非光合组织质粒的膜上或膜腔中都有分布[9]。随着分子生物学技术的成熟和广泛应用，许多植物如苹果、梨、桃、荔枝、甘薯、西红柿、蚕豆、马铃薯、葡萄、菠菜、甘蔗、烟草、杏、枇杷等的ppo基因都已被克隆[10]。目前研究发现，ppo基因在单子叶植物中普遍存在内含子，而在大部分双子叶植物中没有内含子，仅在番荔枝[11]、白杨[12]等少数双子叶植物中发现内含子的存在。2001年，赵东等[13]根据已报道的ppo基因中的保守序列设计引物，首次克隆了茶树ppo基因部分序列;通过序列分析发现茶树ppo基因与其他植物的ppo基因同源性较高，尤其是铜离子结合部位。通过检索最新NCBI数据库发现，目前已有宜红早、碧螺春、安徽1号等茶树品种的17条ppo基因完整或部分序列公布，大小为537～1 800 bp。在茶树ppo基因中均未发现内含子。

植物ppo基因具有多基因家族特性，在不同种类植物和同种植物不同器官中具有不同的时空表达模式。Chi等[14]通过分析马铃薯基因组数据得到9个可能的ppo基因，通过实时定量PCR发现，这些基因不仅在不同组织中的分布和表达量存在较大差异，而且在不同品种中的分布也不同。曾泽媛等[15]通过茶树基因组数据库中获得了5条ppo基因，它们的CDS区全长为597 ～ 1 839 bp，编码氨基酸数目为198 ～ 612个;通过实时定量PCR发现，这些基因在不同品种间呈现出不同表达模式。

2. 酶学性质

（1）底物特异性

PPO能够催化一元酚、二元酚和多元酚等酚类物质氧化形成相应的醌，且对不同类型的底物催化效率差异较大。常用于PPO催化的底物包括邻苯二酚、焦性没食子酸、儿茶素、没食子酸等，其中邻苯二酚常用于茶树PPO酶活测定。Samynathan等[16]分离纯化了UPASI品种中的PPO，研究其底物特异性发现，最适底物为儿茶素，然后依次是邻苯二酚、咖啡酸、L-多巴和连苯三酚，而对没食子酸不起催化作用。伍梦瑶等[17]研究了勐库大叶种PPO的催化特性，发现它对焦性没食子酸、邻苯二酚有催化活性，且对焦性没食子酸的催化效果优于邻苯二酚，而对间苯二酚、对苯二酚基本无催化活性。虞昕磊[18]研究发现，凤庆PPO的最适底物为邻苯二酚和焦没食子酸，可部分氧化没食子酸和对苯二酚，但对间苯二酚催化作用最弱。

（2）pH

PPO的最适pH受到酶来源和选用底物影响。根据资料报道[19]，茶树PPO适宜的反应pH为4.0 ～ 9.0，不同茶树品种PPO或同一品种的不同同工酶的最适pH值存在一定差异。Öztürk等[20]以邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚两种底物测定了茶鲜叶PPO的最适pH，分别为9.0和8.5。Teng等[21]从政和大白茶中纯化出PPO1和PPO2两种同工酶，其最适pH分别为5.5和6.0。许雷[22]纯化出龙井43中的两种PPO同工酶，以邻苯二酚为底物确定两者的最适pH分别为5.6和6.8。

（3）温度

不同来源PPO的活性随温度变化的趋势具有相似性，一般随温度升高先上升后下降，但其最适温度存在差异。茶树PPO最适反应温度在20～40 ℃。Samynathan等[16]分析了UPASI品种中PPO的酶学性质，发现其最适温度为25 ℃，在32 ℃下十分稳定，而在62 ℃下仅15 min就完全失活。Altunkaya[23]纯化了茶鲜叶中的PPO，研究确定其最适温度为30 ℃，并发现其在30 ～ 80 ℃范围内，热稳定性随温度升高逐步下降。许雷[22]分析了龙井43中的两种PPO同工酶催化活性和温度的关系，发现它们的最适温度分别为30 ℃和35 ℃;在25～40 ℃范围内，二者活性均较高，而温度超过60 ℃后，二者基本失活。

（4）金属离子

植物PPO属于金属酶，其催化活性受金属离子的种类和浓度影响。Samynathan等[16]研究了2 mmol/L金属离子对茶树PPO活性的影响，发现K+、Na+、Mg2+和Cu2+具有激活作用，而Hg2+和Ca2+具有抑制作用，其中Hg2+表现出强抑制作用，可抑制90%的酶活力。张元等[24]研究发现，Cu2+在低浓度下对茶鲜叶中PPO具有激活作用，而在高浓度下起抑制作用;Cu2+浓度为0.25×10-7  mol/L时PPO酶活性最高，当Cu2+浓度达2.5×10-7 mol/L时PPO酶活性消失。

二、PPO在茶叶加工中的研究概况

1. 红茶

红茶属于全发酵茶，在其加工过程中通过酶促氧化儿茶素类物质产生茶黄素类色素，并形成其特有的色泽和香气。PPO是酶促氧化中的关键酶，在红茶加工中其酶活性处于动态变化。红茶加工工序主要包括：萎凋、揉捻、发酵和干燥。萎凋是红茶加工的首道工序，该阶段叶片细胞萎缩、细胞汁浓度提高，部分水解酶、氧化酶活性上升。丰金玉等[25]研究发现，PPO在萎凋期间活性随萎凋时间的延长而增加，萎凋结束时PPO活性达到鲜叶PPO活性的2.9倍。揉捻通过外力作用使叶片迅速紧卷形成茶条，破损叶细胞组织，使叶片中的多酚类化合物、蛋白质、氨基酸等物质溢聚叶表皮，与PPO、氧气等充分接触，促进生化变化。Mahanta等[26]研究发现，PPO活性在揉捻过程中达到最高。发酵是形成红茶品质特征的关键工序，实质是以多酚类化合物为主体发生酶促或非酶促氧化反应的化学变化过程。红茶发酵条件对PPO活性有较大影响：高湿有利于PPO酶活性的保持;缺氧会使PPO的含Cu2+活性中心呈脱氧态形式，不利于酶活性的保持和多酚类物质的酶促氧化。Samanta等[27]研究了不同温度对红茶发酵的影响，在不同温度下PPO活性均随发酵进行明显下降。干燥是红茶加工的最后一道工序，不仅能迅速钝化各种酶的活性、固定成茶外形，还能通过高温热作用来激化高沸点的芳香物质，使内含成分发生微妙变化，形成红茶特有的品质特征。

根据资料报道，在红茶加工中，PPO不仅活性发生变化，而且酶组成和性质也有较大改变。Takeo[28]研究发现，PPO活性从萎凋阶段到揉捻阶段持续上升，且在揉捻阶段活性达到了鲜叶活性的2～3倍，而在发酵过程中由于形成不溶性多酚-酶复合体，PPO活性下降。进一步的研究还发现萎凋中有新的PPO酶蛋白出现。屠幼英[29]的研究也得到了类似的结论，通过酶学性质分析提出鲜叶与萎凋叶 PPO 有着质的区别。Ozdemir等[30]研究发现，在揉捻中有不同分子量的PPO形成，对氧化反应和红茶品质起关键作用。

在红茶加工中，提升PPO活性是改善红茶品质的有效途径。Jiang等[31]将不同品种、季节和地区的茶鲜叶加工成工夫红茶，发现具有高PPO活性的茶鲜叶加工的红茶中茶黄素含量较高。Das等[32]以提高PPO和过氧化物酶（POD）活性为目标，优化了萎凋温度、濕度以及持续时间，发现优化后对CTC红茶和传统红茶的品质均有明显提升。Hua等[33]将新型动态发酵方法应用于工夫红茶加工中，发现相比传统发酵方式，该方法通过增加发酵过程中的氧含量有效提高PPO活性，进而促进茶黄素和茶红素形成并改善红茶的品质。此外，在红茶加工中添加水果、蔬菜等来源的PPO促进发酵，也能改善其汤色和香气，并提高茶黄素含量。

2. 绿茶

绿茶是不发酵茶，其关键工序是杀青。杀青过程主要通过高温使鲜叶中包括PPO在内的各种内源酶迅速变性失活，使成品茶保留较多的叶绿素、多酚类、维生素C等品质成分，从而形成绿茶“清汤绿叶”的品质。

吴本刚等[34]将催化式红外杀青技术应用于绿茶杀青，发现该技术不仅能钝化茶鲜叶中90%的PPO活力，而且能去除50%左右的水分，此外，还能使杀青叶保持较高的维生素C和茶多酚含量。郑文佳等[35]通过滚筒加微波叠杀技术钝化茶鲜叶中大部分PPO活性，显著延长了杀青叶贮存时间，以此降低绿茶加工的劳动强度和成本。谭俊峰[36]研究了超高压处理对茶鲜叶的影响，发现经500 MPa以上超高压处理的茶鲜叶中PPO活性显著下降，在杀青前对茶鲜叶进行超高压处理，制得的成品绿茶汤色黄绿明亮，滋味醇和，其香气物质芳樟醇含量较对照提高15倍。

3. 乌龙茶

乌龙茶做青是摇青和静置多次反复交替的过程，摇青使叶片受到一定机械损伤，促进细胞中的内源酶与底物接触，该过程茶青边缘受损程度更高，在PPO等的酶促氧化下引起叶缘红变，达到“绿叶红镶边”的效果。静置主要促进叶片内物质缓慢氧化形成乌龙茶特有品质成分。乌龙茶加工须严格控制好做青程度，若做青不足，不仅酶促反应不够充分，而且叶片和茎梗中内含物不能充分交换，导致茶叶香气前体不能充分释放;做青过度会导致酶促反应过度，致使部分香气物质含量降低，而且还会破坏茶多糖等活性物质。

乌龙茶加工中的温湿度等环境因子与做青工艺对PPO活性和茶叶品质有重要影响。王丽霞等[37]研究了萎凋条件对乌龙茶鲜叶PPO活性的影响，发现相比自然萎凋（温度25 ℃，相对湿度50%～60%），低温（20 ℃）和高濕（相对湿度90 %）条件下萎凋PPO活性更高。王承莉等[38]以PPO比活力和粗多糖质量分数为指标对乌龙茶机械化做青工艺进行了研究，发现投叶量为20 g、温度30 ℃、振摇时间20 min、静置时间10 min、重复2次时，叶片适度发酵、香气良好，有利于形成乌龙茶品质特征。陈倩莲等[39]研究比较了采用炭火和暖气机组两种升温方式对大红袍做青中PPO活性的影响，发现两种升温方式做青后叶片PPO活性均显著下降，但暖气机组升温能改善做青环境，延长做青过程中青叶的活力，促进香气物质的转化生成。

4. 黑茶

黑茶渥堆过程中，微生物大量繁殖，分泌PPO、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶，与茶叶的内源酶一起酶促作用，形成黑茶特有的风味品质。

目前，研究者对黑茶渥堆中PPO活性和种类变化展开了系统研究，并分析了PPO对其品质的影响。柴洁等[40]以云南临沧凤庆大叶种晒青毛茶为原料进行普洱茶固态发酵，发现渥堆过程中PPO活性与比活力均呈波浪式上升趋势，发酵末期PPO活性较初期增强，而酶蛋白含量总体呈下降趋势，但变化比较平稳。胡沛然[41]对六堡茶渥堆前后的PPO进行分析发现，渥堆前毛茶PPO分子量为59 kDa左右，而渥堆结束的样品出现了分别约为59 kDa和70 kDa的两种PPO，其原因可能是真菌在渥堆过程中产生的新的PPO。付赢萱等[42]在普洱茶渥堆中添加外源PPO作用发现，PPO能够加速普洱茶发酵，缩短发酵周期，并改善其品质。

三、展望

尽管目前关于茶树PPO的研究与应用已取得了诸多显著成果，但在以下几个方面仍值得深入研究。

1. 茶树PPO蛋白质结构的解析

目前研究者已成功纯化了多个品种茶树中的PPO，若能进一步解析其蛋白结构，将有助于深入探明其催化机制。

2. 茶叶加工工艺对PPO活性影响的机制

当前的研究主要分析不同加工工艺对PPO酶活力的影响，深入探明其影响机制将有助于更科学地控制各工艺参数。

3. PPO的高效重组表达

当前制约PPO广泛应用的主要因素是难以获得低成本的高活性酶，通过基因工程手段实现PPO的高效重组表达将大幅度拓展其应用范围。

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