藤茶及牛蒡子配伍对耳足致炎鼠的影响

李晓青，张 雷，赵雅欣，孙 睿，雷 雨*

(1.广东润良药业有限公司，广东 珠海 519000；2.北京市密云区卫生健康委员会，北京 101500；3.北京联合大学 应用文理学院，北京 100083)

咽炎在中医说法中为“喉痹”、“慢火喉痹”等，是耳鼻喉科常见病之一[1]。慢性咽炎因诸多因素导致，大多为脏腑虚损、咽喉失养、痰凝血瘀，结聚咽喉[2]。近年来，随着空气质量的持续恶化和人们生活习惯的改变，咽喉极易受到影响而引起一系列问题，严重影响患者的生活质量。开发安全有效的清咽功能保健食品迫在眉睫。中医药主张未病先治的理论符合现代人保健养生的需要。某清咽产品将藤茶及牛蒡子进行配伍，其中藤茶(Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang)又名显齿蛇葡萄叶，性味苦、微涩、凉，常用于清热利湿，平肝降压，活血通络。牛蒡子(Fructusarctii)性味辛、苦、寒，归胃经，对于治疗咳嗽痰多，咽喉肿痛，痄腮丹毒，痈肿疮毒有显著效果。咽炎患者血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白水平(CRP)明显高于正常情况，且三者水平均与疾病严重程度呈明显正相关，均可作为咽喉症状早期预测的参考性指标[3-4]。为进一步开发以该配伍为主要原料的清咽功能保健食品，设计此试验探究其对致炎鼠消炎程度的影响，并结合ELISA技术探究该配伍对棉球致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠，体质量(185±15)g，10周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号：SCXK(京)2019-0008)；SPF级BALB/c雌雄性小鼠，体质量(20±2)g，6周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号：SCXK(京)2019-0008)。实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室(许可证号：SYXK(京)2017-0038)。维持饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号：SCXK(京)2019-0008)生产。分笼饲养，控制室温(25±2)℃，自由摄食、饮水。各剂量组均给予维持饲料。

1.2 试验药物藤茶(批号：20180620，购自贵州江口梵净山云峰野生植物开发有限公司)；牛蒡子(批号：171101，购自安国市深豪药业有限公司)；藤茶牛蒡子浓缩液：取混合样品105.0 g(藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g)，常压、温度80℃，加1 050 mL无菌水浸泡30 min，提取2次，将提取液合并浓缩至70 mL，以下简称“受试物”。

1.3 主要试剂与仪器乙醚(批号：20180119，国药集团化学试剂北京有限公司)；碘伏(批号：15111，山东利尔康牌医疗科技股份有限公司)；致炎剂1%葡聚糖4万(批号：17027002，北京拜耳迪生物技术有限公司)；二甲苯(批号：20190118，国药集团化学试剂北京有限公司)；大鼠TNF-α 酶联免疫(ELISA)试剂盒(批号：202009，赛默飞世尔科技公司)；大鼠IL-6 ELISA试剂盒(批号：202009，赛默飞世尔科技公司)；大鼠CRP ELISA试剂盒(批号：202009，赛默飞世尔科技公司)；BS223S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；T1000电子天平(常熟衡器工业公司)；XR-YLS-25A电动耳肿打孔器(上海欣软信息科技有限公司)；足趾容积测量仪(成都泰盟软件有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；微量加样器(哈美顿实验器材有限公司)。

1.4 试验分组与处理将96只SPF级SD雄性大鼠随机平均分成4组，以生药计分别设定空白对照组、受试物低剂量组(0.38 g/kg)、受试物中剂量组(0.75 g/kg)、受试物高剂量组(2.25 g/kg)，用于棉球植入试验及足趾肿胀试验。将60只SPF级BALB/c雄性小鼠随机平均分成4组，分别设定空白对照组、受试物低剂量组(0.75 g/kg)、受试物中剂量组(1.50 g/kg)、受试物高剂量组(4.50 g/kg)，用于小鼠耳廓肿胀试验。

1.5 测定指标及方法

1.5.1大鼠棉球植入肉芽肿净质量的测定 经口给予大鼠受试物36 d，试验结束前8 d，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入经高压灭菌并烘干、称质量的棉球，缝合切口，继续给予受试物。试验结束当天，给受试物1 h后，断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，置于已称质量洁净平皿中，恒温干燥箱60℃开盖干燥1 h后称质量，计算肉芽肿净质量。

1.5.2大鼠足趾肿胀率的测定 经口给予大鼠受试物36 d，试验结束当天给1次受试样品，1 h后，用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积，作为0 h足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入等量1%葡聚糖4万，分别于1，2，4，6 h测量大鼠足趾的容积，同一部位测量3次，取平均值。以不同时间所测足趾容积与致炎剂作用前的足趾容积之差为肿胀值，计算各个时间段的足趾肿胀率。

1.5.3小鼠耳廓肿胀率的测定 经口给予小鼠受试物36 d，试验结束当天，汲取二甲苯20 μL，滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央，让其自由扩散，30 min 后，将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用9 mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称质量，以两耳质量之差为耳廓肿胀值，计算耳廓肿胀率。

1.5.4大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP的测定 断颈处死末次给药棉球植入大鼠前，自大鼠眼底静脉丛取血，分离血清，低温冰箱冷冻保存。冷冻血清室温下融化，测定方法参照赛默飞世尔科技公司相应ELISA试剂盒操作说明。

1.6 急性经口毒性试验小鼠20只，雌雄各半，试验前禁食4 h，自由饮水。试验期间，动物自由摄食和饮水，末次灌胃后继续禁食2 h。小鼠灌胃受试物1次，灌胃剂量为30 g/kg (以生药计)。连续观察14 d，观察并记录动物的一般状态、体质量变化、中毒体征以及死亡情况等。

2 结果

2.1 对受试动物一般状态和体质量的影响受试动物精神状态、行为活动、摄食摄水等均未见明显异常。给予受试物前后，大、小鼠的体质量在各剂量组与空白对照组间比较差异均无显著性。

2.2 受试物对大鼠棉球植入肉芽肿净量的影响由表1可见，经口给予大鼠受试物36 d后，与空白对照组比较，中剂量组和高剂量组大鼠肉芽肿净量降低，其中中剂量组具有显著性差异(P<0.05)，高剂量组具有极显著性差异(P<0.01)。

表1 大鼠棉球植入试验肉芽肿净量

2.3 受试物对棉球植入大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量的影响经口给予大鼠不同剂量受试物36 d后，与空白对照组比较，中、高剂量组TNF-α含量明显降低，高剂量组的IL-6含量降低，有极显著性差异(P<0.01)。与空白对照组比较，各剂量组血清CRP含量均显著性降低，且有极显著性差异(P<0.01)，大鼠的CRP水平受样品的影响呈现负相关性。

表2 大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP含量水平 ng/L

2.4 受试物对大鼠足趾肿胀率的影响由表3及图1可见，经口给予大鼠受试物36 d后，与空白对照组比较，各剂量组大鼠注射致炎剂后不同检测时间均可见足趾容积降低，且各剂量组部分时间差异具有显著性。其中高剂量组注射致炎剂1%葡聚糖4万后4 h内足趾肿胀率显著降低，有极显著性差异(P<0.01)。低、中剂量组注射致炎剂1%葡聚糖4万后2 h内大鼠足趾肿胀率具有显著性差异(P<0.05)。各剂量受试组均能降低注射致炎剂1%葡聚糖4万导致的足趾肿胀率，注射后6 h达到与空白大鼠足趾肿胀率一致。

表3 注射致炎剂1%葡聚糖4万后1～6 h大鼠足趾肿胀率

2.5 受试物对小鼠耳廓肿胀率的影响由表4及图2可见，经口给予小鼠受试物36 d后，各剂量组小鼠耳廓肿胀率与空白对照组比较均有降低，且差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。

2.6 急性经口毒性试验在观察期14 d内，动物状态正常，无中毒体征和死亡等异常情况，15 d小鼠大体解剖检查，主要脏器未见明显异常。所有小鼠经口急性耐受剂量均大于30 g/kg，按急性毒性分级标准[7]评价，该受试样品属实际无毒。

图1 注射致炎剂1%葡聚糖4万后1～6 h大鼠足趾肿胀率

表4 小鼠耳肿胀试验耳廓肿胀率

图2 小鼠耳廓肿胀试验耳廓肿胀率

3 讨论

咽炎属于中医学“喉痹”范畴，最早见于《皇帝内经》，其中《素问·阴阳别论》“一阴一阳结，谓之喉痹”，以“虚火喉痹”居多[5-6]。随着城市的快速发展，大中型城市的空气污染问题日益严重，雾霾等极端天气首当攻击人体的呼吸系统。本试验研究藤茶及牛蒡子配伍对动物清咽功能的影响，其主要成分藤茶分布较广，适应性强，资源丰富，主要产自我国湖北、湖南、贵州、福建、江西等山区[7-8]。它具有较强的抗氧化作用，有清热解毒、利咽护嗓、保肝护肝、降血脂、降血糖、抗菌消炎、解酒毒、活血化瘀、抗病毒、抗肿瘤，以及免疫增强等功效[9]。牛蒡子中主要含有牛蒡子苷、牛蒡子苷元、罗汉松脂素、牛蒡酚A～H等木脂素类成分和挥发油及油脂类成分[10]。现代药理学研究证明，牛蒡子具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、抗菌等作用[11]。牛蒡子为清咽保健食品常用中药，笔者运用中医药配伍理论，结合对藤茶和牛蒡子清咽作用机制的报道进行分析，藤茶与牛蒡子配伍应用能够缓解咽部不适。

本研究中，经口给予大鼠本藤茶牛蒡子配伍样品36 d后，高剂量组大鼠肉芽肿净重及其血清中TNF-α、IL-6、CRP水平，以及1～4 h足趾肿胀率显著低于空白对照组。高剂量组小鼠耳肿胀率均显著低于空白对照组。该样品对大、小鼠体质量增长均无不良影响，小鼠经口急性耐受剂量均大于30 g/kg,该受试品属于实际无毒。

综上试验结果表明，该藤茶及牛蒡子配伍样品在动物致炎模型中发挥了消炎作用，能有效降低致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP水平，共同协同达到清咽的目的，各组动物脏器均未见明显病变，可为临床两者配伍治疗咽喉症状提供试验依据。