MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生中的作用及机制

张锐

肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤之一[1]，针对肾癌的相关研究一直是人们关注的焦点，基于前期的研究成果，推测“在肾癌发病的过程中，MiR-23a调控着肿瘤增殖、凋亡、侵袭等过程，其作用的结合位点是靶基因HOXC8[2]。为了证实该假说，本研究通过体外、体内实验，采用MiR-23a inhibitor基因沉默的方法作为研究手段，观察MiR-23a及HOXC8在肾癌细胞株中的表达和MiR-23a对肾癌细胞的生物学影响，并在大鼠体内实验中进行验证，揭示MiR-23及HOXC8在肾癌细胞和组织中的表达规律[3]，以及MiR-23a在肾癌细胞的生物学作用，从新的角度揭示肾癌细胞发生、发展的新的机制，为源头防治肾癌提供新的思路及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 一般材料

选取2019年1月培养的大鼠60例，MiR-23a inhibitor转染组（实验组）20例，空载体转染组20例（阴性对照组），空白组20例（空白对照组）。所有大鼠均进行体内与体外两种实验方法。实施方法主要包括细胞培养、细胞转染、反转录反应、引物扩增、实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）实验方法、蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验、动物实验等。

1.2 方法

（1）细胞培养：肾癌细胞株HK-2，786-O，CAKI-1均采用DMEM培养基培养，其内含1%青链霉素的双抗和10%始牛血清。置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中常规培养，每2～3天传代一次，待细胞处于对数生长期用于实验。（2）细胞转染（适用于MiR-23a inhibitor）：①将对数生长期的HK-2，786-O,CAKI-1细胞，分别用胰酶消化，用完全培养基收集细胞，以3.0×105/孔的密度接种于六孔板，接种后将细胞混悬液摇匀，常规条件培养。②过夜培养过后的细胞，状态生长良好，融合密度达到50%～60%，进行转染。转染分为三组，每组均设复孔，以平衡实验误差。分组：MiR-23a inhibitor转染组（实验组）：MiR-23a inhibitor+转染试剂。空载体转染组（阴性对照组）：MiRNA inhibitor negative control+转染试剂（negative control）。空白组（空白对照组）：单加转染试剂（blank control）。③配制转染工作溶液。④细胞转染前1 h，釆用无血清培养基POTI MEMI更换细胞的完全培养基，预处理约1 h。⑤MiR-23a inhibitor的终浓度：1.5 μmol/L。⑥转染后24 h，采集2 mL新鲜的完全培养基更换转染体系。随后根据实验需要在合适的时间节点收集细胞，予进一步实验。（3）细胞总RNA提取。（4）反转录反应、引物扩增。（5）实时定量PCR实验方法，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭，Western Blot实验。（6）动物实验：常规饲养→细胞培养及转染同上→皮下（左侧腹股沟）接种，控制肿瘤大小10～15 cm→记录瘤体大小→每3天观察并记录瘤体大小→第29天处死大鼠测量肿瘤体积→称取肿瘤组织进行Western Blot实验。

1.3 观察指标

观察体外实验中MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生表达的变化及在体内实验中MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生表达的变化。

1.4 统计学处理

利用统计学软件SPSS 22.0对数据进行分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2进行检验，计量资料以（x-±s）表示，进行F检验，组间比较用t值检验；采用皮尔森相关性检验进行相关性研究，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验中MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生表达的变化

在三组肾癌细胞系中转染MiR-23a inhibitor后抑制了细胞增殖，促进了细胞凋亡，降低了细胞侵袭性，同时HOXC8的表达下调，MiR-23a inhibitor转染组HK-2、786-O、CAKI-1、HOXC8均显著低于空载体转染组及空白组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），具体统计结果见表1。

表1 三组大鼠肝组织中肾癌细胞株的表达比较 （±s）

表1 三组大鼠肝组织中肾癌细胞株的表达比较 （±s）

注：t1、P1为MiR-23a inhibitor转染组与空载体转染组比较，t2、P2为MiR-23a inhibitor转染组与空白组比较

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2.2 体内实验中MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生表达的变化

在体内实验中转染MiR-23a inhibitor后抑制了肿瘤的生长，其机制与下调HOXC8的表达有关，具体统计结果见表2。

表2 Pearson相关性分析

3 讨论

肾癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，早期症状不典型，晚期预后差[4]。近年来，新的证据显示一些MiRNA在肾癌的发生和发展中起着重要作用[5]。因此，学术领域多项研究为了解MiR-23a在肾细胞癌中的分子机制，并确定其潜在的临床价值，采用流式细胞术和流式细胞术检测MiR-23a在肾细胞癌中的表达及其增殖、迁移和凋亡[6]。通过生物信息学分析、逆转录-定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription PCR，RTqPCR）、Western Blot和荧光素酶报告子分析来识别和检测MiR-23a与其潜在靶点之间的关系。相关研究了118例福尔马林固定石蜡包埋的RCC标本中MiR-23a-3p表达与临床病理变量或总生存率（OS）的关系，RCC细胞系和TCGA数据库。上调MiR-23a-3p可增强ACHN和786-O细胞系中MiR-23a-3p，而沉默MiR-23a-3p则可抑制细胞活力、增殖和移动性[7]。此外，MiR-23a-3p的过度表达可抑制细胞凋亡。另据相关研究[8]进一步揭示MiR-23a-3p通过靶向富含脯氨酸的核受体辅活化子2（proline rich nuclear receptor coactivator，PNRC2）来调控肿瘤的发生。cox比例风险回归分析显示MiR-23a-3p低表达患者的OS显著延长，该项研究结果表明MiR-23a-3p不仅可以作为一种新的预后生物标志物，而且可以作为一种新的治疗策略[9]。但是目前显少见MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生中的作用及机制的相关研究[10]，为了进一步证实MiR-23a靶向HOXC8在肾癌发生中的作用及机制，本研究针对MiR-23a靶向HOXC8的表达，采取了体内实验与体外实验。研究结果显示，在三组肾癌细胞系中转染MiR-23a inhibitor后抑制的细胞增殖，促进了细胞凋亡，降低了细胞侵袭性，同时HOXC8的表达也下调。组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在体内实验中转染MiR-23a inhibitor后抑制了肿瘤的生长，其机制与下调HOXC8的表达有关[11]。目前，MiR-23a已被基因芯片分析证实为多种疾病的致癌基因。然而，MiR-23a作为最常见的肾肿瘤，其在肾癌中的表达及功能尚不清楚[12]。本研究采用RT-qPCR和细胞计数试剂盒、Transwell、MTT和流式细胞术检测MiR-23a靶向HOXC8在肾细胞癌中的作用。研究表明，MiR-23a靶向HOXC8在肾细胞癌组织中的表达明显下降。此外，转染MiR-23a inhibitor后抑制了肿瘤的生长，其机制与下调HOXC8的表达有关。

综上所述，本研究结果提示MiR-23a是肾癌发生发展过程中的一个癌基因，MiR-23a靶向HOXC8的相关性来看，可能是肾癌的一个新的治疗靶点。