不同检测方法在丙型病毒性肝炎诊断中的应用

刘丽花 徐昕

丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV）是单股正链RNA病毒，主要经血和血制品传播。据流行病学分析，2015年全球HCV的感染率为2.8%，呈逐年上升趋势[1]。丙型肝炎潜伏期与病程均较长，病情发展较为缓慢，疾病后期会导致患者出现肝脏慢性纤维化或者炎症坏死等并发症，由于HCV的病毒特性，患者感染病毒病程少见自限性痊愈，多迁延性发展为慢性丙型肝炎，10～20年之后发展为肝硬化，肝细胞肝癌，对患者生命安全造成威胁[2]。另外，丙型肝炎患者会由于肝细胞癌或者肝衰竭导致死亡，临床尚无有效的预防与治疗方法，需要通过早期检测与干预来改善患者预后[3]。临床检测丙型病毒性肝炎所采用的方法主要有酶联免疫法、磁微粒化学发光法、胶体金法及实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），对丙型肝炎病毒核糖核酸（hepatitis C virus-ribonucleic acid，HCV-RNA）载量与HCV抗体进行综合检测可对慢性丙型肝炎的感染情况进行明确，同时还可对病毒的复制情况进行判断。HCV感染的病原学检测是确定和治疗决策的重要依据，本次研究旨在探讨不同实验室检测方法在丙型病毒性肝炎临床诊断中的应用，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2018年1月—2020年1月临床诊断为丙型肝炎的患者100例，其中65例男性，35例女性；年龄最小25岁，最大76岁，平均年龄（50.52±6.53）岁；病程范围0.3～1.2年，平均病程（0.75±0.25）年。详见表1。临床诊断标准参考《丙型肝炎防治指南（2015更新版）》[4]，所有入组患者均抽取静脉血3～5 mL，常规分离血清后分装保存于-20℃以下冰箱待冷冻保存备用。本研究经患者同意，经医院伦理委员会批准。纳入标准：（1）均签署知情同意书；（2）均无肝炎史；（3）均存在厌油及右上腹部不适症状；（4）均具有完整的临床资料。排除标准：（1）合并其他肝部疾病者；（2）依从性较低者；（3）存在意识障碍及认知障碍者；（4）存在精神障碍者。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫法 采用Microlab STRA IVD酶免仪（瑞士澳斯邦生物工程有限公司，ELISA Star 8ch）其配套试剂进行检测，采用间接法原理检测人血清中的丙型肝炎病毒抗体。样本A值＜临界值（cut off）为丙型肝炎病毒-免疫球蛋白G（hepatitis virus C-immunoglobulin G，HCV-IgG）阴性，样本A值≥临界值（cut off）为HCV-IgG阳性。

1.2.2 磁微粒化学发光法 采用AutoLumo A2000 Plus全自动化学发光仪（郑州安图生物工程股份有限公司）以及全套试剂，所有操作严格按照试剂说明书进行，待测样本发光值＜cut off值时，检测呈阴性反应，待测样本发光值≥cut off值时，检测呈阳性反应，cut off值=阳性对照孔平均值×0.4。

1.2.3 胶体金法 采用胶体金免疫层析技术，应用间接法原理测定人血清中HCV抗体，15 min内观察结果。HCV显示阳性：试纸卡在检测线（T）和对照线（C）位置出现两条紫红色条带，阴性：试纸卡只在对照线（C）位置出现一条紫红色条带。

1.2.4 实时荧光定量PCR 采用QIAamp Viral RNA miniKit核酸提取试剂盒提取病毒核酸，采用中山大学达安基因股份有限公司提供的HCV-RNA FQ-PCR试剂盒在ABI 7500仪器（美国罗氏公司，Light Cycler 480Ⅱ）进行检测，所有操作严格按照试剂盒说明书及设备进行，将定量结果≥1×103IU/mL判定为阳性。

1.3 统计学方法

选用SPSS 22.0统计学软件分析数据，计量资料以（x-±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

磁微粒化学发光法阳性率为99.00%，酶联免疫法阳性率为98.00%，略高于胶体金的94.00%，但三种检测方法阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。实时荧光定量PCR法的阳性率为53.00%（53/100），主要用于检测病毒载量。

表1 不同检验方法的检验结果比较[例（%）]

3 讨论

丙型肝炎是由HCV感染引起的一系列肝功能异常、损伤、甚至肝癌的一类传染性疾病，发病率较高且逐年上升，对患者身体健康有严重影响，甚至威胁到其生命安全，已成为非常严重的公共卫生问题[5]。丙型肝炎的病程相对较长且转阴率较低，目前对丙型肝炎的发病机制并不十分明确。有研究认为HCV的直接损伤是急性丙型肝炎的主要病因，宿主免疫的损伤作用可能与慢性丙型肝炎的发病机制有关，特异性体液免疫及细胞免疫可能发挥了重要作用[6]。患者发病早期无明显症状，也未出现相关不适感，极易被忽视，患者甚至不愿意入院接受检查，随着病情进展患者病情逐渐加重，导致其错过最佳治疗时间，增大治疗难度，一旦漏诊或者误诊会导致患者出现肝硬化与肝癌等恶性并发症，甚至导致患者死亡[7]。当前尚无治疗丙型肝炎的特效疫苗或者方式，在早期预防方面存在较大难度，由于该病具有传染性，尽早实施有效诊断可降低发病率，控制病情进展，改善患者预后，因此早期诊断对疾病治疗意义重大[8]。

丙型肝炎主要由丙型肝炎病毒所导致，病毒进入人体之后会出现病毒血症，丙型肝炎病毒还会对细胞内大分子的合成造成干扰，导致溶酶体膜通透性发生变化，引起细胞病变。就肝细胞来说，丙型肝炎病毒表达物所产生的毒性作用不但会损伤患者肝脏，还会损害其他脏器功能。临床尚无预防丙型肝炎的有效疫苗，健康人群可通过体检筛查来预防疾病发生，及时发现并且及时治疗，进而有效预防疾病的发生。对丙型肝炎的诊断首先需要对抗-HCV抗体及HCV核糖核酸等标志物进行检验，若以上标志物的检验结果为阳性，可将其确诊为丙型肝炎。另外，还要通过肝脏功能的超声检验与生化检验等方式与诊断标准相结合，进而确定丙型肝炎。丙型肝炎的传染源较为复杂，主要为无症状亚临床患者、急性临床患者、慢性患者与病毒携带者，一般情况下，患者在发病前12 d其血液就存在感染性，并且病毒可携带12年以上，主要传播途径为血源传播，国外输血之后确诊为丙型肝炎的人数在30%～90%之间，我国输血之后确诊为丙型肝炎的患者在所有肝炎人群中占有1/3，其他传播方式如家庭日常接触传播、母婴垂直传播及性传播。输入含有HCV-RNA或者HCV的血液制品或者血浆之后，一般情况下需要经过6～7周的潜伏期后可急性发病，患者主要临床表现为肝区不适、全身无力及胃纳差，约1/3患者会出现黄疸、ALT升高及抗HCV抗体阳性，大约50%的丙型肝炎患者会逐渐发展为慢性肝炎，部分患者甚至会发展为肝硬化与肝细胞癌，半数患者属于自限性，可自动康复。该病的发病机理尚未完全清楚，HCV在细胞内复制会对肝细胞蛋白的合成造成干扰，甚至会导致肝细胞功能与结构发生变化，导致肝细胞变性坏死，可见HCV会对患者肝脏造成直接损害，对于疾病的发生有促进作用。患者一旦感染HCV，产生的保护性免疫力相对较差，在急性感染之后血液中首先发现HCV-RNA，之后才会发现抗HCV，并且最早对HCV-RNA的检出时间为暴露后2周。

完善的病原学检测是慢性HCV感染筛查、监测、诊断和治疗的基础。酶联免疫法是临床应用广泛的丙型肝炎检测方法，也是应用最早的检测方法，主要通过酶催化且放大反应效果的方式进行检测，虽然阳性率较高，但操作较为繁琐，需要进行批量检测，所花费的资金较多。在医疗技术不断发展的情况下，新的检测技术在临床广泛应用，相对于酶联免疫法这种操作复杂且价格昂贵的检测来说，研究人员更倾向于简单、便捷且高效的检测方法[9-10]。磁微粒化学发光法是先进的技术手段，所用时间较短，可自动进行稀释并重新检测，准确率较高。胶体金法在丙型肝炎的检测中得到广泛应用，主要将抗体与抗原之间的反应通过层析法进行检测，采用胶体金判断阳性与阴性可使得检测准确率不断提高，漏诊率与误诊率不断降低，并且该种检测方式操作简便快捷，不需要特殊设备即可完成检验，可用于初步诊断，对丙型肝炎的预防与控制方面具有较高的应用价值[11-12]。荧光定量PCR法是近年发展的生物学检测技术，主要是在常规的PCR技术中应用荧光探针或者荧光染料，然后通过累积的荧光信号对整个PCR过程进行监测，之后对其进行定量分析，可很好的弥补其他检测方式存在的弊端，定量准确率高可真实反映HCV的复制情况，但检查繁琐且费用昂贵。研究中酶联免疫法的检测阳性率为98.00%，磁微粒化学发光法的检测阳性率为99.00%，两种检测方法的检测阳性率之间无显著差异（P＞0.05），表明对丙型肝炎的检测均有显著的临床效果。胶体金法的检测阳性率为94.00%，主要用于初筛实验[13]。三种方法之间差异无统计学意义（P＞0.05）。实时荧光定量PCR法的检测阳性率为53.00%，现主要用于已确诊的HCV感染患者的病毒载量。

HCV-IgG是反映是否感染过HCV的指标，对慢性肝炎的诊断有重要意义。HCV-RNA是HCV感染的直接证据，为确诊丙型肝炎，监测病毒水平，确定治疗方案和抗病毒疗效观察提供依据。

综上所述，综合检测HCV抗体和HCV-RNA载量可以明确诊断慢性丙型肝炎感染和判断病毒复制情况。