硬枝碱蓬多糖通过肠肌间神经丛抑制家兔离体十二指肠收缩及机制*

沙爱龙，郝海燕

1. 重庆三峡学院教师教育学院，重庆 404120

2. 重庆三峡学院生物与食品工程学院/重庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆 404120

3. 重庆三峡学院环境与化学工程学院/三峡库区水环境演变与污染防治重庆市重点实验室，重庆 404120

硬枝碱蓬Suaeda rigidaKung et G. L. Chu，属石竹目Caryophyllales 藜科Chenopodiaceae 碱蓬属Suaeda中最高大的双子叶植物，为塔里木盆地特有种［1］，主要分布于新疆阿克苏-巴楚一线地区，生活力强、生物量大、营养成分含量高，当地居民常采集其嫩叶以作野菜食用。因为硬枝碱蓬分布范围狭窄，其分布区人口密度低，科研院所、高校少，故目前国内外对其研究报道很少。本课题组前期对硬枝碱蓬的化学成分及药理作用进行了初步研究，结果表明硬枝碱蓬含有多糖、生物碱、挥发油、黄酮、皂甙等化学成分［2］，具有抗氧化［3］、促进机体生长及抗病能力等药理作用［4］。笔者曾研究硬枝碱蓬多糖对免疫抑制小鼠血清中NO 含量及NOS 活性的影响，结果表明，硬枝碱蓬多糖可通过显著抑制NOS 并最终抑制NO 的细胞毒性作用而对正常组织细胞发挥保护作用，并进一步增强小鼠的免疫力［5］，由此可推断多糖可能是硬枝碱蓬重要活性成分之一。目前有关硬枝碱蓬多糖其他药理作用的研究尚未见报道。已有研究表明植物多糖可影响小肠收缩［6-7］，本实验拟通过硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠平滑肌收缩性的影响及其作用机制，研究硬枝碱蓬中抑制胃肠运动的有效成分，以期为新药的研发提供新思路，也可为治疗胃肠运动功能亢进和硬枝碱蓬的开发利用提供新的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康成年家兔，体质量2.0 ～2.5 kg，雌雄不拘，由塔里木大学动物科学学院动物实验站提供。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂硬枝碱蓬，采自新疆生产建设兵团第一师阿拉尔市十二团，经课题组鉴定。蛋白酶抑制剂购自Sigma 公司，氯化乙酰胆碱（Ach）、硫酸阿托品、盐酸维拉帕米均购自国药集团化学试剂有限公司，亮氨酸脑啡肽（Leu-enk）ELISA 试剂盒、甲硫氨酸脑啡肽（Met-enk）ELISA 试剂盒均购自上海晶抗生物工程有限公司，酪氨酸羟化酶（TH）ELISA试剂盒购于美国ProSci公司，乐氏液（KCl 0.42 g，NaCl 9 g，CaCl20.24 g，NaHCO30.2 g，葡萄糖1.0 g，蒸馏水1 000 mL；所用试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2 仪器MedLab-U/4C501 型生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司），JZ101 型张力换能器（北京新航兴业科贸有限公司），HW-400E 恒温平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司），PowerWave XS 全波长酶标仪（美国Bio-Tek 宝特），低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），精密电子天平（上海精科天平），电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 硬枝碱蓬多糖的提取方法按照课题组先前的研究方法制备硬枝碱蓬多糖［5］。将制备得到的灰白色固态絮状硬枝碱蓬多糖2.00 g，置于100 mL 容量瓶中用蒸馏水溶解，即得高质量浓度硬枝碱蓬多糖溶液（20 mg/mL）。后稀释2次，各稀释1倍，分别得到10、5 mg/mL 中、低质量浓度的硬枝碱蓬多糖溶液。

1.3.2 家兔离体十二指肠平滑肌标本的制备及收缩活动记录家兔禁食24 h 后，采用颈椎脱臼处死，迅速剖开上腹，剪取靠近胃幽门端的十二指肠段约2 cm，轻轻剥离附着其上的脂肪组织，而后置于37 ℃乐氏液中。稳定10 min 后，用棉线将十二指肠段一端连张力换能器并连接MedLab 生物信号采集处理系统，另一端系于恒温平滑肌槽试验片底端L 型钩上，试验片置于盛有18 mL 乐氏液的试验管内，调节棉线刚好垂直，使离体肠段悬浮于实验管中央。设定恒温平滑肌槽水温37 ℃，每秒钟通过内置气泵通入1～2 个气泡。记录肠段收缩曲线，稳定10 min 后，开始实验，记录指标包括收缩频率和收缩幅度。

1.3.3 不同质量浓度硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响实验采用分别加入的方法，即加入一种质量浓度的硬枝碱蓬多糖并观察其效果后，用37 ℃乐氏液冲洗2～3 次，再加入另一质量浓度硬枝碱蓬多糖。按照低（5 mg/mL）、中（10 mg/mL）、高（20 mg/mL）质量浓度的顺序依次进行实验，各质量浓度硬枝碱蓬多糖加入试验管后分别观察记录6 min，以加药前1 min的肠段收缩曲线作为对照，记录3个质量浓度组的硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响，并计算收缩频率和幅度的变化率

为了研究硬枝碱蓬多糖对十二指肠平滑肌收缩影响的作用机制，按照“1.3.4～1.3.6”所述方法继续设计了如下实验。

1.3.4 硬枝碱蓬多糖对ACh诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响待十二指肠段收缩曲线稳定后，向试验管内加入ACh（0.1 μmol/L），作用3 min 后加入高质量浓度硬枝碱蓬多糖（20 mg/mL），此期间观察记录家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的变化。另设一组用硫酸阿托品（1 μmol/L）作为阳性对照。

1.3.5 硬枝碱蓬多糖对CaCl2诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响待肠段收缩曲线稳定后，向试验管内加入CaCl2（0.1 mol/L），作用3 min 后加入高质量浓度硬枝碱蓬多糖（20 mg/mL），此期间观察记录家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的变化。另设一组用盐酸维拉帕米（0.1 μmol/L）作为阳性对照。

1.3.6 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠中Leuenk、Met-enk含量和TH活性的影响将36 只家兔随机分为4 组，即正常对照组（乐氏液组），低、中、 高质量浓度硬枝碱蓬多糖组（n=9）。制备各组家兔离体十二指肠平滑肌标本，分别取乐氏液和低、中、高质量浓度硬枝碱蓬多糖浸浴各组离体十二指肠肠段，6 min 后，将肠段剪碎，置于9倍的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入蛋白酶抑制剂后用冰水浴匀浆10 min 制成10%组织匀浆，经反复冻融3 次后，5 000 r/min 离心5 min 后取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书分别测定各组Leu-enk、Met-enk含量和TH活性。

1.3.7 数据统计分析实验结果数据以均数±标准差（-x±s）表示，数据分析在SPSS 19.0软件上进行。组间数据采用t检验或单因素方差分析，进一步组间比较选用Dunnett-t检验。P<0.05 为统计学差异显著，P<0.01为统计学差异极显著。

2 结 果

2.1 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩频率的影响

与给药前相比，硬枝碱蓬多糖3个剂量组对家兔离体十二指肠收缩频率均具有抑制作用，其中低剂量组抑制不显著（P>0.05）、中剂量组抑制显著（P<0.05）、高剂量组抑制极显著（P<0.01），抑制率也随剂量升高而逐渐增强，呈现一定的剂量依赖效应。

表1 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩频率的影响1）（n=9）Table 1 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contractile frequency of the isolated duodenum in rabbits（n=9）

2.2 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩幅度的影响

由表2 可知，与给药前相比，硬枝碱蓬多糖3个剂量组对家兔离体十二指肠收缩幅度均具有抑制作用，其中低剂量组抑制不显著（P>0.05）、中剂量组抑制显著（P<0.05）、高剂量组抑制极显著（P<0.01），其抑制率随剂量升高而逐渐增强，呈现一定的剂量依赖效应。

表2 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠收缩幅度的影响1）（n=9）Table 2 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contractile amplitude of the isolated duodenum in rabbits（n=9）

2.3 硬枝碱蓬多糖对ACh 诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响

由表3可知，与给药前相比，单独应用ACh极显著增加了家兔离体十二指肠收缩频率和幅度（P<0.01）。加入硬枝碱蓬多糖（20 mg/mL）后，收缩频率和幅度均明显下降，作用效果与硫酸阿托品相当，与ACh 相比差异均极显著（P<0.01）。

表3 硬枝碱蓬多糖对ACh诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响1）（n=9）Table 3 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the frequency and amplitude of contraction of the isolated rabbit duodenum induced by ACh（n=9）

2.4 硬枝碱蓬多糖对CaCl2诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响

由表4 可知，与给药前相比，单独应用CaCl2极显著增加了家兔离体十二指肠收缩频率和幅度（P<0.01）。加入硬枝碱蓬多糖（20 mg/mL）后，与CaCl2相比，收缩频率和幅度均极显著降低（P<0.01），作用效果与盐酸维拉帕米相当。

表4 硬枝碱蓬多糖对CaCl2诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响1）（n=9）Table 4 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the frequency and amplitude of contraction of the isolated rabbit duodenum induced by CaCl2（n=9）

2.5 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠Leu-enk、Met-enk含量和TH活性的影响

硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠组织中Leu-enk、Met-enk 含量和TH 活性的影响结果见表5。与正常对照组相比，硬枝碱蓬多糖3 个剂量组家兔离体十二指肠组织中Leu-enk、Met-enk 含量均减少，其中低剂量组差异不显著（P>0.05），而高剂量组差异均极显著（P<0.01）；中剂量组的Leu-enk 差异不显著（P>0.05），但Met-enk 差异却极显著（P<0.01）。硬枝碱蓬多糖3 个剂量组家兔离体十二指肠中TH 活性均高于正常对照组，且呈现一定的剂量依赖效应趋势，其中低剂量组差异不显著（P>0.05），而中、高剂量组差异均极显著（P<0.01）。

表5 硬枝碱蓬多糖对家兔离体十二指肠Leu-enk、Met-enk含量和TH活性的影响（n=9）Table 5 Effects of Suaeda rigida polysaccharides on the contents of Leu-enk and Met-enk and the activity of TH in the isolated duodenum of rabbit（n=9）

3 讨 论

与骨骼肌类似，十二指肠平滑肌收缩也是在肌膜动作电位触发下发生兴奋-收缩耦联，触发因子也是Ca2+，不同处在于Ca2+浓度的调控存在电-机械耦联和药物-机械耦联两条途径［8］。电-机械耦联使肌膜中的ICa-L将细胞外Ca2+释放进胞质内；药物-机械耦联是外源性药物通过激活G 蛋白耦联受体-磷脂酶C（PLC）-三磷酸肌醇（IP3）信号通路生成IP3，最终介导肌质网内Ca2+释放进胞质中引起的［8］。

十二指肠的活动受神经和体液因素的影响。体液因素包括十二指肠平滑肌细胞膜上存在的多种离子通道和受体，当信使分子激活离子通道时或神经递质、外源药物与膜上受体结合时会引起平滑肌细胞信号转导通路发生变化，由此调控其运动。神经因素包括外来神经（交感和副交感）和肠神经系统的调节，家兔十二指肠离体后虽失去外来神经的支配，但肠神经系统仍存在［9］。肠神经系统由胃肠道壁内两层神经结构组成，内含大量神经元和神经纤维，可分为肌间神经丛和黏膜下神经丛，其中黏膜下神经丛主要调节上皮细胞和腺细胞功能，而位于环形肌和纵行肌之间的肌间神经丛则主要支配平滑肌的活动［8］。十二指肠平滑肌运动主要受肌间神经丛调节和支配，构成肌间神经丛的神经元通过释放不同的神经递质调节十二指肠运动，这些神经递质可分为两类，兴奋性神经递质如Ach、脑啡肽（Enk）、P 物质等可促进十二指肠运动［10］，抑制性神经递质如肾上腺素、去甲肾上腺素（NE）、生长抑素等则起抑制作用［11］。

Ach 是十二指肠运动的兴奋性神经递质，与肠肌膜上的G蛋白耦联M受体结合后激活腺苷酸环化酶（AC），使细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）浓度升高，激活蛋白激酶A（PKA），进而激活ICa-L使细胞外Ca2+内流增多［12］。Ach 还可以通过与M 受体结合后激活G 蛋白亚型耦联受体，再激活PLC，产生IP3和二酰甘油（DG），再激活肌浆网膜中的IP3受体，肌质网内Ca2+释放进胞质中，从而导致十二指肠平滑肌收缩增强［13］。由本实验结果可知，硬枝碱蓬多糖能极显著（P<0.01）抑制Ach、CaCl2分别对肠收缩频率和幅度的促进作用，抑制效果分别与硫酸阿托品和盐酸维拉帕米相当，而硫酸阿托品和盐酸维拉帕米分别为常用的M 胆碱受体阻断药和ICa-L阻断药。故此说明，硬枝碱蓬多糖可能通过抑制G 蛋白耦联M 受体介导的AC- cAMPPKA 和PLC-IP3-Ca2+信号转导通路及Ca2+信号系统（如抑制肌膜ICa-L进而抑制Ca2+- CaM 信号通路），从而抑制离体十二指肠平滑肌收缩。

Enk 也是十二指肠运动的兴奋性神经递质，属内源性阿片神经肽家族的一员，主要包括Leuenk、Met-enk两种，本课题组前期研究表明Enk是δ 阿片受体的内源性配体［14］。通过与G 蛋白耦联δ受体结合，Enk 可激活肠肌膜上GTP 结合蛋白［15］，使细胞内cAMP浓度升高，激活蛋白激酶K（PKK）和Ca2+依赖性蛋白激酶C（PKC）［16］，进而激活Ca2+信号系统［17］，导致十二指肠平滑肌收缩增强。TH是NE 合成的限速酶，可作为NE 能神经元活性的标志，TH 表达升高直接引起NE 合成增多［18］，而NE 属于肾上腺素能β 受体激动药，可通过激活G蛋白耦联β 受体介导的AC- cAMP- PKA 信号转导通路，从而松弛十二指肠平滑肌。ELISA 实验中，硬枝碱蓬多糖3个剂量组家兔离体十二指肠组织中Leu-enk 和Met-enk 含量均不同程度减少，TH 活性均不同程度升高，表明硬枝碱蓬多糖可能通过调节肌间神经丛运动神经元的活动而影响十二指肠运动。硬枝碱蓬多糖可能通过降低Leu-enk和Metenk 含量，抑制G 蛋白耦联δ 受体介导的GTPcAMP-（PKK 或PKC）信号通路及Ca2+信号系统，从而抑制离体十二指肠收缩；并可能通过升高TH 活性引起NE 增多，再激活G 蛋白耦联β 受体介导的AC-cAMP-PKA 信号转导通路，从而松弛离体十二指肠平滑肌。

综合本研究结果可得知，多糖为硬枝碱蓬中抑制十二指肠运动的有效成分，作用机制可能是通过肠肌间神经丛抑制G 蛋白耦联M 受体介导的AC-cAMP-PKA 和PLC-IP3-Ca2+信号转导通路及Ca2+信号系统（如抑制肌膜ICa-L进而抑制Ca2+-CaM信号通路）；可能通过抑制肌间神经丛运动神经元释放Leu-enk 和Met-enk，从而抑制G 蛋白耦联δ受体介导的GTP-cAMP-（PKK 或PKC）信号通路及Ca2+信号系统；并可能通过促进肌间神经丛运动神经元释放TH引起NE增多，再激活G蛋白耦联β受体介导的AC-cAMP-PKA 信号转导通路。硬枝碱蓬多糖有望在胃肠运动功能亢进等疾病的新药研发中发挥作用，本研究也为拓展硬枝碱蓬临床新用途提供了基础理论依据。