有机酸对石灰土上龙葵生长及Cd富集的影响

罗洋， 刘方， 朱健， 罗绪强， 杨晓斓， 孙丽

(1.贵州师范学院地理与资源学院，贵州 贵阳 550018；2.贵州大学资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025)

镉是生物非必需元素，在体内蓄积至一定程度后会导致植物质膜破坏和生长发育受阻，也会造成动物或人体骨骼和神经系统受损等严重后果[1]。近年来，大量镉通过化肥施用、污泥农用、污水灌溉、矿产资源开采冶炼和工业及生活“三废”途径进入土壤，威胁着动植物生长和人类健康。据2014年国土资源部发布的《全国土壤污染公报》显示，中国土壤镉的点位超标率已达7%，是污染最广的重金属元素[2]。因此，选择适宜的方法来修复镉污染土壤，是实现可持续发展和生态文明建设的必然要求。

螯合剂能与土壤重金属发生键合/螯合作用，使重金属从不溶态转变成可溶态，形成水溶性的金属-螯合剂络合物，从而提高植物对重金属的提取效率[3-4]，也常被用于强化Cd污染土壤的植物提取修复中。传统的EDTA等螯合剂虽然应用较为广泛，对Cd有效性的提升效果也较好，但在土壤中生物毒性大、持续时间长、降解能力差，存在潜在的生态风险[5]。天然低相对分子质量有机酸(LMWOA)作为螯合剂的一类，因为具有降解性好、能与Cd 络合形成低毒害的物质进而提高重金属生物有效性等优势[6]。近年来学者们尝试应用LMWOA如草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和氨三乙酸等与植物联合作用来修复Cd污染土壤，表现出了一定的应用前景[7]。然而，目前在有机酸对植物 Cd 吸收积累方面仍没达成统一认识，主要是因为其修复效果受到植物种类、有机酸种类与浓度、土壤条件和污染元素性质等多种因素的影响[8]。

龙葵(SolanumnigrumL.)是中国发现的一种镉超积累植物，具有生物量较大、适应性强、生长迅速等特点，是用于提取土壤中镉的良好材料[9-10]。为提高其修复效率，学者们从添加促生菌、螯合剂、植物生长调节剂和肥料等外源物质，并结合农艺调控措施等方面开展了系列工作，取得了一定成果[11-13]。目前，有关龙葵对Cd修复的研究大多采用的是酸性或中性土壤，对于微碱性和碱性土壤缺乏关注。石灰土主要发育在碳酸盐岩类风化物上，大多呈弱碱性，是贵州省的第二大土类，约占全省土壤面积的17.5%[14]。前期研究表明，受碳酸盐岩风化成土过程中Cd 的相对富集的影响，石灰土的Cd背景值普遍较高[15]；孙子媛等[16]采用实地调查和地球化学测试分析等手段，也发现石灰土剖面Cd和As的超标程度最大，存在的潜在危害不容忽视。因此，近年来对贵州省石灰土镉污染问题的研究逐渐增多，但目前主要集中在含量特征与污染风险评价、吸附解析特性、化学淋洗效应和对农作物的毒性效应等方面[17-20]，尚未见到采用有机酸与超积累植物联合施用修复效果的报道。本研究以石灰土为供试土壤，采用盆栽试验，结合植物生长指标和Cd含量指标的测定，探讨不同类型和浓度的有机酸对龙葵提取修复Cd的强化效果，以期为贵州省石灰土镉污染的治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤：采自贵州师范学院后山，土壤类型为石灰土，自然风干挑出杂物后过2 mm筛。其基本理化性质为：pH值为8.38；有机质含量12.35 g·kg-1；碱解氮含量94.08 mg·kg-1；速效磷含量8.22 mg·kg-1；速效钾含量115.67 mg·kg-1。通过添加CdCl2溶液的形式，直至配成Cd质量浓度为6.86 mg·kg-1的模拟污染土壤，室温下平衡1个月分装到塑料盆中，每盆装土3.5 kg。

供试植物：龙葵，种子购于网上农资专卖店。

供试有机酸：主要为草酸(OA)、柠檬酸(CA)和氨三乙酸(NTA)，所用试剂均为优级纯。

1.2 试验设计

试验于2019年6—9月在贵州师范学院温室大棚进行，共设计7组处理，分别为：CK(不加有机酸)、OA2.5(2.5 mmol·kg-1草酸)、OA5(5 mmol·kg-1草酸)、CA2.5(2.5 mmol·kg-1柠檬酸)、CA5(5 mmol·kg-1柠檬酸)、NTA2.5(2.5 mmol·kg-1氨三乙酸)和NTA5(5 mmol·kg-1氨三乙酸)，每个处理重复3次。龙葵种子经质量分数为75%的酒精浸泡30 s杀菌处理后，用蒸馏水清洗干净，选取颗粒饱满的龙葵种子播种于育苗钵中，置于室温培养，待长至4片真叶时，选择长势良好、大小一致的幼苗移栽于塑料盆中，每盆3株。移栽30 d后，将有机酸一次性加入土壤。生长过程中保持土壤含水量为田间持水量的70%左右，移栽90 d后收获。将植株挖出，分为地上部和根部，经自来水冲洗、去离子水润洗后用吸水纸擦干，测定株高和鲜质量。于105 ℃杀青30 min，然后在60 ℃条件下于恒温干燥箱(上海一恒，DHG-9030)中烘干，测量干质量，再用植物粉碎机(东莞房太，800A)磨碎，装袋保存，供镉含量的测定分析。

1.3 测定项目及方法

龙葵采用HNO3-H2O2消解体系(体积比为5∶2)，在微波消解仪(成都奥普乐，APL)中按如下程序消解：升温至120 ℃，保持20 min；升温至160 ℃，保持20 min；升温190 ℃，保持40 min至液体透明澄清；土壤采用HNO3-HCl-HF-H2O2体系(体积比为3∶1∶1∶1)下，在微波消解仪中按如下程序消解：升温至120 ℃，保持7 min；升温至150 ℃，保持9 min；升温190 ℃，保持25 min至液体透明澄清，然后用火焰原子吸收光谱仪(novAA 350)测定消解液Cd含量，在样品处理过程中，利用标准物质(土壤为GSS系列，植物为GSV系列)、平行样、空白对照等进行质量控制试验，所用试剂均为优级纯。

土壤有效态Cd采用0.1 mol·L-1HCl浸提，火焰原子吸收光谱仪(novAA 350)测定；土壤pH采用pH计(m(水)∶m(土)=2.5∶1)测定。

富集系数(BCF)=龙葵Cd含量(μg·g-1)/土壤Cd含量(μg·g-1)；转运系数(TF)=龙葵地上部Cd含量(μg·g-1)/龙葵根部Cd含量(μg·g-1) 。

1.4 数据处理

采用Excel 2007 进行试验数据的处理，所得结果以平均值加减标准差形式体现，用LSD法在P<0.05水平上进行处理间差异性比较，采用SPSS 22.0进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同有机酸对龙葵生长的影响

由表1可知，龙葵的株高、单株鲜质量和干质量等生长指标随着有机酸类型和浓度的变化而有所不同。添加草酸能促进龙葵的生长，当其施用浓度为5 mmol·kg-1时龙葵的株高、单株鲜质量和单株干质量都比其余处理大，分别比CK增加了13.82%、29.24%和51.85%，差异均达显著水平(P<0.05)。与对照相比，低浓度(2.5 mmol·kg-1)的柠檬酸对龙葵的生长没有显著影响(P>0.05)，当其施用浓度提升至5 mmol·kg-1时，反而使株高显著降低了18.26%，单株鲜质量和单株干质量无明显变化。氨三乙酸的施用对龙葵的生长产生了明显的毒害作用，并且随着施用浓度的提高，其抑制效应越强。其中NTA5处理组的株高、单株鲜质量和单株干质量分别比CK显著降低了17.50%、48.73%和55.56%，也显著低于草酸和柠檬酸处理组(P<0.05)。

表1 不同有机酸对龙葵株高和地上部生物量的影响Table 1 Effects of different organic acids on plant height and aboveground biomass of Solanum nigrum L.

2.2 不同有机酸对龙葵富集和转移Cd的影响

经过3个月的盆栽后，龙葵地上部Cd含量在65.06～84.20 μg·g-1之间，各处理大小顺序为OA5>OA2.5>NTA5>NTA2.5> CK>CA2.5>CA5(表2)。从中可以看出，柠檬酸的添加会略微降低龙葵地上部Cd含量，但与对照相比未达显著水平；而草酸和氨三乙酸则能强化龙葵地上部对Cd的富集，其中OA2.5、NTA2.5、OA5和NTA5处理组的龙葵地上部Cd含量与对照组相比增幅分别为28.23%、11.85%、28.30%和26.51%，差异均达显著水平(P<0.05)。就同一种有机酸而言，主要表现为低浓度(2.5 mmol·kg-1)促进作用弱于高浓度(5 mmol·kg-1)，其中OA2.5和OA5处理组的数值接近，而NTA2.5和NTA5处理组则有显著差异。

植物对Cd的修复效率主要取决于其地上部Cd积累量[21]，其数值等于地上部干重和Cd浓度的乘积，不同处理下龙葵地上部的Cd提取量状况如表2所示。不添加有机酸(CK)时，单株龙葵的地上部Cd提取量为18.00 μg·株-1。随着有机酸类型和浓度的不同，Cd提取量呈现多种变化趋势。添加氨三乙酸后，总提取量分别下降至11.72 μg·株-1(NTA2.5)和10.00 μg·株-1(NTA5)，仅为对照的0.65和0.56倍，差异达显著水平(P<0.05)；添加柠檬酸后，龙葵地上部Cd提取量为19.47 μg·株-1(CA2.5)和17.72μg·株-1(CA5)，与对照无明显区别；添加草酸后，龙葵地上部对Cd的总提取量较对照有明显提升，增加至27.22 μg·株-1(OA2.5)和34.47 μg·株-1(OA5)，分别是对照的1.51倍和1.92倍，2个浓度处理组之间无显著差异。

龙葵作为Cd超积累植物，在本试验中富集系数最小值为9.60(CK)，最大值为12.34(OA5)之间，转移系数最小值为1.23(CK)，最大值为2.88(NTA5)，表明其体内Cd浓度高于土壤中，且以地上部富集为主(表2)。OA2.5、OA5和NTA5 3个处理之间龙葵对Cd的富集系数无明显区别，但都显著高于NTA2.5处理组。此外，与对照相比，草酸和氨三乙酸这2种有机酸施用后都使龙葵地上部Cd富集系数呈显著增加趋势(P<0.05)，而柠檬酸则没有体现出明显的影响。由表2可知，不同处理条件下龙葵对Cd的转移系数大小顺序为NTA5>OA5>NTA2.5>CA2.5>OA2.5>CA5> CK，添加有机酸的处理组数值都高于对照，除CA5外，与CK相比均有显著差异(P<0.05)。同一种酸方面，氨三乙酸和草酸处理组的转移系数均表现为高浓度>低浓度，而柠檬酸则相反。

表2 不同有机酸对龙葵富集和转移Cd的影响Table 2 Effects of different organic acids on Cd accumulation and transfer in Solanum nigrum L.

2.3 不同有机酸对土壤有效态Cd的影响

对土壤中重金属的有效性进行分析，能够表征重金属被生物吸收利用或产生毒害的程度[22]，3种有机酸添加后土壤有效态Cd含量的变化如图1所示。OA5处理组的土壤有效态Cd含量高于其余处理，为2.64 μg·g-1，比CK(2.10 μg·g-1)增加了27.72%，与除OA2.5和NTA5以外的处理相比差异显著(P<0.05)。 从图1还可以看出，OA2.5、NTA5、NTA2.5、CA5和 CA2.5处理组与CK相比土壤有效态Cd含量的变幅分别为13.81%、7.62%、6.19%、-4.76%和-9.52%，差异均未达显著水平(P>0.05)，说明除了5 mmol·kg-1的草酸外，其余类型和浓度的有机酸添加并没有对土壤中Cd的有效性产生明显影响。

注：柱状图上小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。下同。

2.4 不同有机酸对土壤pH值的影响

土壤pH值是控制重金属吸附-解吸和沉淀-溶解平衡的主要因素，能决定重金属的赋存形式和生物有效性[23]。3种有机酸的添加对土壤pH值产生了一定的影响，具体变化情况与有机酸的类型及其施用浓度有关(图2)。龙葵在生长过程中根际会分泌一定量的有机酸、氨基酸等物质，使得盆栽后土壤pH值较原土有所降低。试验后各处理与对照土壤的pH值相比也呈下降趋势。降幅最大的是草酸处理组，其土壤pH值分别比CK显著下降了0.27(OA2.5)和0.32(OA5)，和其他处理相比也有显著差异(P<0.05)；其次是氨三乙酸处理组，降幅分别为0.16(NTA2.5)和0.18(NTA2.5)，与对照及其他有机酸之间差异显著(P<0.05)；而柠檬酸处理组的降幅仅为0.02(CA2.5)和0.03(CA2.5)，和对照相比并无显著区别。同一种酸处理条件下，均表现为高浓度处理(5 mmol·kg-1)的土壤pH值降幅大于低浓度处理(2.5 mmol·kg-1)，但相互之间差异并不明显(P>0.05)。

图2 不同有机酸对土壤pH值的影响

2.5 土壤pH值、土壤有效态镉含量与龙葵镉含量的相关性

对土壤pH值、土壤有效态Cd含量与龙葵地上部Cd含量间进行了相关性分析(表3)，结果表明，本研究中土壤pH值与土壤有效态Cd含量和龙葵地上部Cd含量均呈极显著负相关(P<0.01)，其相关系数分别为-0.723和-0.870，说明pH值是影响土壤Cd有效性的重要因素。土壤有效态Cd含量与龙葵地上部Cd含量的相关系数为0.572，也达极显著相关关系(P<0.01)，表明土壤有效态Cd含量的降低是阻碍龙葵地上部Cd吸收的重要原因。

表3 土壤pH值、土壤有效态Cd含量与龙葵地上部Cd含量之间相关性Table 3 Correlation between soil pH, soil available Cd content and aboveground Cd content of Solanum nigrum L

3 结论与讨论

超积累植物是指地上部分的重金属积累量是普通植物的100倍或以上，要高于一定的临界值，即Cd含量在100 μg·g-1以上，Co、Cu、Ni、Pb 含量在1 000 μg·g-1以上，Mn、Zn含量在10 000 μg·g-1以上且对重金属的转运系数大于1的植物[24]。超积累植物的生长状况是反应植物提取修复能力的重要指标[25]。因此，在利用有机酸等螯合剂活化土壤中的Cd进而强化植物提取修复的同时，也要关注这些外源物质添加后对超积累植生长的影响。结果表明，3种低相对分子质量有机酸对植物生长的影响各异。其中促进效果最强的是5 mmol·kg-1的草酸，能使龙葵的株高、单株鲜质量和单株干质量等指标与对照相比均有显著提高；与之不同的是，两种浓度下的柠檬酸施用对龙葵生长无明显影响，而氨三乙酸甚至显示出了显著的抑制作用。可能是因为在同一浓度下，草酸的解离常数最高，最易解离和释放H+，导致土壤pH值降幅大于柠檬酸[26]，将其添加到土壤后使呈微碱性的石灰土中的部分养分得到释放，改善了根际环境和营养状况。而氨三乙酸虽然也能降低土壤pH值，但其本身对龙葵可能具有一定毒害效应，再与Cd胁迫状况进行叠加，引起龙葵的黄化、萎蔫，甚至是死亡，进而造成株高和生物量的降低[27-29]。

利用低相对分子质量有机酸活化土壤中的重金属来提高植物对重金属的吸收, 是植物修复研究的方向之一。但低相对分子质量有机酸对土壤中重金属的活化和植物对重金属的吸收随有机酸的种类和重金属元素的类型而异[30-31]。本研究发现，草酸和氨三乙酸2种有机酸的添加均显著提高了龙葵对Cd的富集能力，使龙葵的地上部Cd含量和富集系数呈增加趋势，而柠檬酸促进作用不明显。原因主要有两方面，一是在本研究中土壤酸碱性与Cd有效性呈极显著负相关关系。与柠檬酸相比，草酸和氨三乙酸添加后使土壤pH值的降低幅度更大，不仅可以提高土壤溶液的离子态Cd的浓度，而且可以促进土壤中矿物的解析，使得土壤中的黏粒、氧化物等表面电荷发生变化，从而减少对镉的吸附能力，使得土壤有效态镉含量增加，利于植物对Cd的吸收[32]；二是不同种类的有机酸所含的功能基团和螯合能不同，对土壤Cd2+解吸的促进能力也不相同[33]，具体机制有待进一步研究。迁移系数是指地上部某元素质量分数与根系某元素质量分数之比，是用来评价重金属元素从根部向地上部迁移能力的指标。3种有机酸添加后均促进了Cd从龙葵根部向地上部的迁移，可能是因为有机酸提高了Cd的流动性，激活了细胞质膜上的ATP酶，引起负责重金属转运的离子通道发生了变化，从而改变了Cd在龙葵根部和地上部之间的分配[34]。地上部Cd提取量是在叠加了植物生长状况及重金属吸收状况的综合反映，能够评判强化方法或措施对修复效率影响的总体结果。本研究发现，氨三乙酸的施用对龙葵的生长抑制作用大于其对Cd吸收的促进作用，因此2个浓度(2.5 mmol·kg-1和5 mmol·kg-1)下，地上部单株提取量和对照相比均有显著降低。在一定浓度范围内，施加草酸能实现石灰土上龙葵生物量提升与Cd含量增加的“双赢”，促进龙葵对Cd污染土壤的修复。

本研究通过在Cd污染石灰土上添加3种类型和两个施用浓度的有机酸，来探讨其对龙葵修复Cd污染土壤的强化效果。综合植物生长指标和Cd含量指标，发现5 mmol·kg-1的草酸能够显著提高龙葵的修复效率，并从土壤Cd有效性的变化及土壤pH值的变化方面对其作用机理进行了初步探讨。然而，土壤是一个复杂的综合体，土壤养分、土壤物理性质、土壤酶活性和土壤微生物状况均有可能对植物的生长及Cd形态变化产生影响[35-37]，需要进行多角度的分析，才能对作用机理有更深刻的认识。本研究取得的是室内盆栽试验结论，在野外实践中，随着气候和地形等自然地理条件的变化，其施用效果如何，有待进一步探讨。