肝硬化合并肝性脑病患者血清代谢产物水平分析

李立峰，胡公义，侯若南，吴 和，齐艳红

(温州医科大学附属第二医院 1.急诊医学科；2.全科医学科，浙江 温州 325000)

肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)是一种由于急、慢性肝功能严重障碍或各种门静脉-体循环分流异常所致的，以代谢紊乱为基础的，轻重程度不同的神经精神异常综合征。HE是肝硬化患者严重并发症之一，也是肝硬化患者死亡的常见原因之一[1]。据统计，国外肝硬化患者HE发生率高达30%～45%[2]，国内肝硬化患者HE发生率为10%～50%，概率随肝功能损害程度加重而升高。肝硬化患者并发HE后，若救治不及时死亡率极高，有文献[3]报道其1年存活率低于50%，3年存活率低于25%。早期快速诊断、科学客观评估病情有助于准确判断肝硬化并发肝性脑病患者的预后，提高肝性脑病患者的救治成功率。当前尚缺乏对肝性脑病诊断和评估的有效实验室指标，本研究通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，采用主成分分析法和最小二乘法判别分析对肝性脑病患者血清代谢成分进行分析，结合生化指标检测等手段，寻找诊断和评估病情的特征性代谢产物，为临床肝性脑病的诊断和治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1 月—2019年12月于温州医科大学附属第二医院急诊留观的肝硬化合并肝性脑病患者18例，男12例，女6例，平均年龄(55.3±10.5)岁。同时选取肝硬化未合并肝性脑病的53例患者作为肝硬化对照组，男35例，女18例，平均年龄(54.1±11.1)岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象由本人或代理人签署知情同意书。本研究经温州医科大学附属第二医院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准 肝硬化的纳入标准参考人民卫生出版社第八版《内科学》[4]的诊断标准:(1)有乙肝肝硬化或酒精性肝硬化病史；(2)有肝功能减退和门静脉高压的临床表现；(3)有血浆白蛋白下降、总胆红素升高、凝血酶原时间延长等异常指标，提示肝功能失代偿期；(4)超声或影像学结果提示肝硬化，内镜结果提示胃底食管静脉曲张。肝组织活检见假小叶的形成是诊断肝硬化的金标准。肝性脑病的纳入标准[5]：(1)有严重肝病或广泛门-体分流的基础；(2)意识障碍、智力异常、精神紊乱，可引出扑翼样震颤(+)；(3)有明确 HE 诱因；(4)反映肝功能损害的生化指标明显异常或血氨明显增高；(5)脑电图典型改变有重要参考价值。排除标准：(1)既往有神经系统疾病；(2)器官移植术后；(3)恶性肿瘤；(4)妊娠；(5)HIV感染。

1.3 UPLC-MS/MS分析 入院6 h内，经静脉穿刺术采集患者全血，离心取血清(3 000 r/min离心10 min，离心半径13.5cm)。100 μL血清样品加300 μL乙腈，涡旋混合1 min，4℃ 13 000 r/min(离心半径13.5cm) 离心10 min。取150 μL上清液于进样瓶的内衬管中，取2 μL注入UPLC-MS/MS分析。采用ACQUITY UPLC和XEVO TQS-micro三重四级杆液质联用仪(Waters公司，美国)，UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱分离，柱温为40℃。采集的血浆供HPLC-MS检测，优化色谱条件使色谱峰充分分离，标记信噪比>10的色谱峰并进行峰面积积分。

1.4 常规生化分析 采用全自动生化分析仪(日本日立公司)检测患者血清白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)、INR、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Sr)，白蛋白(Alb)和血氨等生化指标。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规生化指标水平比较 与肝硬化对照组比较，肝性脑病组患者血氨水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；两组间WBC、Hb、PLT、INR、ALT、Sr、Alb水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者常规生化指标水平比较

2.2 血清代谢产物水平比较 与肝硬化对照组比较，肝性脑病组患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎宁酸、阿拉伯醇、乙酰肉碱和犬尿氨酸水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者血清代谢产物水平比较

3 讨论

目前，肝性脑病早期诊断和病情评估主要依据患者临床表现，神经生理学、神经心理学测试，影像学检查及肝功能、血氨等实验室检查。当前尚缺乏对肝性脑病准确诊断和评估的方法和实验室指标。本研究结果显示，常规生化指标中仅血氨水平肝性脑病患者比肝硬化组明显升高，其他常规生化检测指标无明显差异。UPLC-MS/MS检测能够高效、灵敏、准确地探索分析未知化合物，目前广泛应用于生物代谢组学研究[6-8]。本研究采用UPLC-MS/MS技术检测两组患者血清成分，共检测出20种代谢物，与肝硬化组比较，肝性脑病组患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎宁酸、阿拉伯醇、乙酰肉碱和犬尿氨酸水平明显升高。

本研究结果显示，乙酰化代谢产物明显增加(乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺)，可能是由于高血氨影响三羧酸循环代谢，导致丙酮酸氧化β-氧化途径代偿性增加，产生大量的乙酰辅酶A，进而导致乙酰化代谢产物的增加，提示肝性脑病患者体内发生能量代谢改变。目前，有关肝性脑病能量代谢的变化主要通过动物或细胞水平进行研究[9]。Weiss等[10]研究发现，肝性脑病患者脑脊液中三羧酸循环中间体的水平没有变化，但丙酮酸、酰肉碱和乙酰化化合物的水平增加。肉碱和酰肉碱水平的急剧增加可能反映了三羧酸循环活性的降低，可能与脂肪酸β-氧化途径的代偿性增加有关。本研究同样发现肉碱类代谢产物增加，肉碱类代谢产物是脂肪酸代谢途径的产物，进一步说明肝性脑病患者体内脂肪酸氧化途径激活可能与体内三羧酸能量代谢途径被抑制而导致其他能量代谢途径代偿性增加有关。本研究结果显示肝性脑病组患者乙酰肉碱水平明显增加，而其他肉碱类代谢物水平变化无统计学意义。目前，肝硬化患者中肉碱和酰基肉碱水平的研究存在一定的争议。Tang等[11]观察到随着原发性胆汁性肝硬化的发展，肉碱(如丙酰肉碱和丁酰肉碱)水平逐渐下降。然而，亦有文献[12]报道肝硬化患者血浆中的酰基肉碱水平升高，而肉碱水平未改变。而有文献[13]报道肉碱和乙酰肉碱可预防高氨血症，并可改善高血氨对患者的毒性作用，尤其是对肝硬化患者[14]和肝性脑病患者[15]。

本研究结果还显示，苯丙氨酸、奎宁酸、阿拉伯醇和犬尿氨酸在肝性脑病组患者中明显增加，提示苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢以及醇类代谢等途径在肝性脑病患者中均显著增强。Dabos等[16]采用核磁共振谱(nuclear magnetic resonance, NMR)的代谢组学研究将肝硬化患者与肝性脑病患者进行区分，基于酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙酮酸和甘氨酸代谢物特征区分肝性脑病患者和肝硬化患者，与本研究的部分代谢产物相类似，提示血清酪氨酸、苯丙氨酸等代谢物对识别肝硬化患者是否合并肝性脑病具有重要意义。肝性脑病患者往往存在芳香族氨基酸/支链氨基酸比例失调，支链氨基酸水平降低导致过多的酪氨酸、苯丙氨酸等代谢产物进入大脑，产生假神经递质，导致中枢神经传导异常，最终出现意识障碍或昏迷，这也是肝性脑病患者出现认知障碍的重要原因。

综上所述，合并与未合并肝性脑病肝硬化患者具有相似的代谢障碍，提示肝性脑病和肝硬化具有相类似的病理生理机制，肝性脑病是肝硬化更为严重的阶段。本研究通过UPLC-MS/MS检测肝性脑病和肝硬化患者血液代谢产物变化，研究结果对肝性脑病的临床诊断及治疗具有一定的意义。