miR-138调控Notch-1信号通路对脑胶质瘤细胞增殖与分化作用及其机制研究

吕 尧，戴伟民，揭园庆，余国峰

(衢州市人民医院 神经外科，浙江 衢州 324000)

脑胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤，主要治疗方式包括外科手术和放化疗[1-2]。微小RNA(micro RNA， miRNA)可调控蛋白编码，影响蛋白表达，在许多信号通路中起到关键作用[3]。近年来研究发现miRNAs在脑胶质瘤患者和脑组织正常人群中的表达具有差异性。李会兵等[4]认为miR-138异常表达可影响脑胶质瘤细胞增殖、侵袭以及凋亡，梁燕等[5]认为Notch-1信号通路活化可促进脑胶质瘤细胞增殖与分化。本研究观察脑胶质瘤患者miR-138和Notch-1信号通路相关蛋白表达情况，观察miR-138表达水平对人脑胶质瘤细胞株U-87 MG Notch-1信号通路相关蛋白表达的影响，探讨miR-138在脑胶质瘤中的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 试剂与材料 人脑胶质瘤细胞株U-87 MG购自上海素尔生物科技有限公司，miR-138转染试剂购自上海吉玛公司，Trizol试剂、PVDF膜、U6内参检测试剂盒购自Invitrogen公司，2 000 bp DNA marker购自郑州实验器材有限公司，牛血清蛋白(BSA)购自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)、CCK 8试剂盒购自Gibco公司，miRNA荧光定量PCR试剂盒购自Stratagene Crop公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司，高速离心机购自德国Eppendrof公司，荧光定量PCR仪(7500Fast)购自美国ABI公司。

1.2 研究对象一般资料 2018年1月—2019年1月于衢州市人民医院收集18例鉴定为脑胶质瘤患者的脑组织活检标本和5例神经外科脑外伤手术患者的正常脑组织活检标本，采集标本前均获得患者或家属知情同意，本研究获得医院伦理委员会批准。脑胶质瘤患者平均年龄(52.33±13.42)岁，男12例、女6例， WHO分级：I级5例、Ⅱ级6例、Ⅲ级7例，病理学类型：星形细胞瘤11例、间变少突胶质细胞瘤4例、间变星形细胞瘤3例。脑胶质瘤患者纳入标准：符合脑肿瘤诊断标准[6]，病理检查确诊为脑胶质瘤，临床资料完整；排除合并其他肿瘤疾病及精神疾病、抑郁症等与脑部相关的疾病患者。5例脑外伤手术患者平均年龄(52.41±12.78)岁，男3例、女2例。脑组织取出后用生理盐水冲洗干净，置于液氮中迅速冷冻保存备用。

1.3 组织miR-138表达水平检测 取出组织标本，在液氮预冷研钵里研磨，利用Trizol法提取组织总RNA，逆转录成cDNA，逆转录条件为16℃ 5 min、42℃ 45 min、85℃ 5 min和10℃停止。利用荧光定量PCR检测脑组织miR-138表达水平，每例标本设3个复孔，94 ℃作用3 min，94℃ 作用20 s，反应40个循环；62℃作用40 s，反应40个循环。结果采用2-ΔΔCt法计算。

1.4 细胞培养与转染 人脑胶质瘤细胞株U-87 MG用含10%胎牛血清和90%RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期的细胞以1.5×105个/孔接种于细胞培养6孔板中。实验分为Mimics组、Inhibitor组、Blank组，Mimics组细胞转染脂质体复合物和miR-138 mimics，Inhibitor组细胞转染脂质体复合物和miR-138 inhibitor，Blank组只加脂质体。按照Trizol说明书提取细胞总RNA，逆转录成cRNA后，采用荧光定量PCR检测miR-138表达水平。

1.5 Western Blot法 检测Notch-1信号通路相关蛋白Notch-1和Hes-1的表达，组织和细胞提取的蛋白按BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，与TBST按1∶200稀释一抗，室温封闭2 h。洗膜后加入与TBST按1∶4 000稀释二抗，室温孵育1 h；化学发光、显影、定影，扫描胶片，结果用Image Pro Plus 6.0 分析目标条带的积分光密度(IOD)值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白IOD值/内参IOD值。

1.6 半定量PCR法 检测Notch1 mRNA和Hes1 mRNA水平，用Trizol法提取组织和细胞总RNA，按RT-PCR 试剂盒说明书步骤将总RNA逆转录成cDNA，以PCR产物量作为衡量相应基因表达水平的半定量指标，用电泳凝胶置于凝胶图像分析系统(quantity-one分析软件)行半定量分析，计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值表示mRNA相对表达量。

1.7 细胞增殖实验 96孔培养板中分别接种2×103个/孔的Mimics组、Inhibitor组和Blank组转染细胞，每组设3个复孔。培养24 h后弃去培养基，分别加200 μL细胞培养基和10 μL CCK溶液置于二氧化碳培养箱培养4 h。各组转染细胞测定450 nm波长吸光度值，24 h/次，连续3次，绘制生长曲线。

1.8 细胞分化实验 细胞转染16 h后，换含10% FBS培养基对各组细胞进行诱导分化，以WST-8法[7]测定培养0、3、5、7 d的活细胞数，根据活细胞的增殖数目判断各组细胞的分化能力。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，2组间计量资料比较采用t检验，3组及3组以上组间计量资料比较单因素方差分析；方差齐时两两比较进行LSD检验，方差不齐时采用Dunnett T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织miR-138表达水平 miR-138表达水平在不同WHO分级和病理类型的脑胶质瘤组织中的差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 脑胶质瘤组织和正常脑组织miR-138表达水平比较

表1(续)

2.2 组织Notch-1和Hes-1表达水平 与正常脑组织比较，病理类型为星形细胞瘤、间变少突胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤的Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA相对表达量均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 脑胶质瘤组织和正常脑组织的Notch-1和Hes-1表达水平比较

2.3 脑胶质瘤细胞株U-87 MG miR-138、Notch-1和Hes-1表达水平 脑胶质瘤细胞株U-87 MG Blank组、Mimics组、Inhibitor组的miR-138 相对表达量分别为0.63±0.02、0.92±0.05、0.46±0.05，差异具有统计学意义(F=101.966，P<0.001)。3组间Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中Mimics组相对表达量最低，Inhibitor组相对表达量最高。见表3。

表3 脑胶质瘤细胞株U-87 MG Notch-1和Hes-1表达水平

2.4 脑胶质瘤细胞株U-87 MG体外增殖情况 CCK8实验结果显示，在24、48、72 h时与Blank组比较，Mimics组450 nm波长吸光度值均下降，Inhibitor组450 nm波长下吸光度值均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：*与Blank组比较，P<0.05。

2.5 脑胶质瘤细胞株U-87 MG体外分化情况 WST-8检测结果显示，在3、5、7 d与Blank组的活细胞数比较，Mimics组的活细胞数均降低，Inhibitor组均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：*与Blank组比较，P<0.05。

3 讨论

脑胶质瘤是以细胞异质性、快速增殖、血管生成、广泛性侵袭、缺氧和坏死为主要特点[8]。研究[9]显示，miRNA在脑胶质瘤的诊断、化疗药物疗效的评估、抗血管生成、治疗及预后判断等方面具有重要的临床意义。miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，可以特异性结合靶基因mRNA的非编码区，调控蛋白质编码基因而影响生物学功能[10]。已发现上千种miRNA参与调控人体内基因的表达，miRNA参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学过程，不同疾病、不同组织部位或同种疾病不同病变程度miRNA表达水平不同，因此miRNA可作为某些疾病或病变程度的预测物，如miRNA可预测结肠癌预后情况[11]，血清miRNA-21可预测肾癌临床病理特征的关系以及术后复发情况[12-13]。miR-138包括位于人类3号染色体(Ch3p21.32)的miR-138-1和16号染色体(Ch16q13)的miR-138-2，广泛表达于机体组织中[14]。miR-138在多种肿瘤疾病中呈低表达[15-16]。Notch信号是一组跨膜受体，由Notch受体、配体、Notch调节分子和其他的效应物组成，细胞之间相互作用可产生Notch信号激活Notch通路。Notch-1是Notch其中一种跨膜受体，影响细胞的生长发育、增殖分化，促进肿瘤或抑制肿瘤生成[17-18]。研究[19]证实，Notch-1信号通路在胶质瘤中充当重要角色，Notch-1信号通路影响胶质瘤的发生发展。

本研究结果显示，脑胶质瘤患者的miR-138表达水平在WHO分级与病理类型分型中存在差异，且WHO分级Ⅱ级、Ⅲ级以及病理类型为星形细胞瘤、间变少突胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤的miR-138表达水平明显降低。进一步检测组织中Notch-1信号通路相关蛋白水平发现，与正常脑组织相比，病理类型为星形细胞瘤、间变少突胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤的脑胶质瘤组织的Notch-1和Hes-1表达水平明显增高，提示Notch-1信号通路活化与脑胶质瘤患者发生相关。人脑胶质瘤细胞株U-87 MG转染miR-138 mimics后，miR-138相对表达量升高，Notch-1信号通路相关蛋白Notch-1和Hes-1表达水平降低，细胞增殖和分化作用下降；转染inhibitor后，miR-138相对表达量降低，Notch-1和Hes-1表达水平升高，细胞增殖和分化作用增强；推测miR-138可能通过负向调控Notch-1信号通路抑制肿瘤细胞增殖和分化。

综上，不同WHO分级与病理类型分型的脑胶质瘤患者的miR-138水平在存在差异，miR-138可能通过负向调控Notch-1信号通路抑制脑胶质瘤细胞U-87 MG增殖和分化，后续仍需进行大样本研究或动物实验验证。