天麻素对单侧前庭功能丧失大鼠前庭内侧核中GLU-IR、GFAP、GABA B2 表达及疗效的影响★

2021-09-10冷辉张琦马贤德姜宇晴石磊王爱平

中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志 2021年4期

冷辉张琦马贤德姜宇晴石磊王爱平

前庭系统实现空间定位、情感调节、记忆等功能有赖于前庭系统的前庭外周感受器以及前庭中枢的功能整合。如果前庭功能存在异常，患者往往表现为眩晕，站立不稳，走路向一侧偏斜等症状，患者除了眩晕本身带来的痛苦，因为眩晕而增高的跌倒风险无疑雪上加霜。流行病学调查显示眩晕患病率为4.1%（10 岁以上人群）[1]。美国NIH 针对60 岁以上人群的调查显示，患有前庭功能障碍比例则高达64.8%[2]。

前庭代偿是指损伤前庭系统外周部后行为的恢复过程。一侧迷路切除后促进代偿药物的研究是一个重要的问题。研究促进前庭代偿药物有助于明确行为恢复的机制和促进前庭失支配恢复药物的研究。本研究观察单侧前庭功能丧失大鼠及经不同剂量天麻素治疗后前庭内侧核中GLU-IR、GFAP、GABA B2 表达的变化，探讨天麻素促进前庭功能恢复及中枢代偿的机制。

资料与方法

1 实验动物

99只SPF 级SD 大鼠，雄鼠50 只，雌鼠49 只，体重（200±20）g，于实验动物中心适应性常规喂养一周。

2 实验方法

2.1实验分组

将99 只成年健康SD 大鼠随机分为KBDZ 组（n=9）、JSSDZ 组（n=18）、MXDZ 组（n=18）、MXZL 组（n=54），然后将MXDZ 组和MXZL 组大鼠进行单侧迷路破坏，模型评价成功后，再次将MXZL 组大鼠随机分为TMSGJL 组（n=18）、TMSZJL 组（n=18）、TMSDJL 组（n=18）。

2.2造模方法

JSSDZ 组（假手术对照组）：鼓室内注射生理盐水（0.1～0.2ml/耳）。

MXDZ 组（模型对照组）：鼓室内注射50%氯仿（0.1～0.2ml/耳）[3]。

2.3模型评价

注射后1h 进行模型评价。

2.3.1行为学特征及失衡行为评分

参考Petrosini 报告的方法[4]对头偏斜、躯干卷曲、肢体外展、强迫环形运动、头震5 个失衡症状分别进行评分，单项指标最严重为2 分，无症状为0分，总分在0～10 分之间。

2.3.2头偏斜的测量

测量由骶骨中央至第一胸椎中央处和由鼻尖至颅顶正中两延长线间的夹角并计数[5]。

2.4干预方法

KBDZ 组（正常饲养组）：正常饲养，不作处理。

术后1h，进行如下处理，肌肉注射均每日1 次，连续3d。

JSSDZ 组（假手术对照组）、MXDZ 组肌肉注射生理盐水（75mg·kg-1·d-1）。

TMSDJL 组（天麻素低组）：肌肉注射50mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

TMSZJL 组（天麻素中组）：肌肉注射75mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

TMSGJL 组（天麻素高组）：肌肉注射100mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

2.5样本采集

KBDZ 组（空白对照组）随机抽取3 只，余各组随机抽取6 只，采用过量麻醉法处死，迅速将置于冰面上断头完整取全脑浸泡于4%多聚甲醛中，室温固定，用于免疫组织化学法检测各项指标。

各组剩余大鼠经过量麻醉法处死，置于冰面分离左侧前庭内侧核，用手术刀将其等分为2 份，一份置于冻存管中存于-80℃冰箱，用于western-blot法检测；另一份加入Trizol 浸泡置于冻存管中存于-80℃冰箱，用于RT-PCR 法检测。

2.6GLU-IR、GFAP、GABA B2 的表达水平检测

2.6.1免疫组化法

实验操作步骤参照本课题组文献报道[6]，以生物信号采集系统测定平均光密度值，平均值作为目的蛋白相对表达水平。

2.6.2RT-PCR 法

取Trizol 液浸泡的组织于液氮中研磨成粉，滴加Trizol 液提取总RNA，测浓度、质量采用一步法RT-PCR 试剂盒检测各mRNA 表达水平。引物序列见表1。经ABI Prism 7500 HT 序列检测系统检测CT 值并计算相对表达量[7]。

表1 引物序列表

2.6.3western-blot 法

实验操作步骤参照本课题组文献报道[8]，测定目的蛋白条带和内参条带的灰度值，并以目的条带灰度值/内参条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。

3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 模型评价

麻醉清醒后，MXDZ 组和MXZL 组大鼠均出现明确的前庭功能失衡症状。MXDZ 组、TMSGJL 组、TMSZJL 组、TMSDJL 组与KBDZ 组、JSSDZ 组比较失衡症状评分、头偏角明显升高（P<0.01），见图1、表2。

图1 大鼠前庭功能失衡状态

表2 模型评价（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01,与KBDZ 组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与JSSZ 组比较。

2 免疫组化法检测GLU-IR、GFAP、GABA B2 的表达

JSSDZ 组与KBDZ 组比较，无统计学差异（P＞0.05）。MXDZ 组、MXZL 组与JSSDZ 组、KBDZ 组比较GLU-IR 表达下调（P<0.05），GFAP、GABA B2 的表达上调（P<0.05）。治疗后，MXZL 组与MXDZ 组比较：GLU-IR、GABA B2 的表达明显上调，GFAP 的表达明显下调（P<0.05），TMSGJL 组下调明显（P<0.05），见图2、表3。

表3 免疫组化法检测结果（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01,与KBDZ 组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与假手术组比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与MXDZ 组比较；○P＜0.05，○○P＜0.01，与TMSGJL 组比较；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01，与TMSZJL 组比较。

图2 免疫组化法检测结果

3 采用PCR 法检测GLU-IR、GFAP、GABA B2 mRNA表达水平

JSSDZ 组与KBDZ 组比较，无统计学差异（P＞0.05）。MXDZ 组、MXZL 组与JSSDZ 组、KBDZ 组比较GLU-IR 表达下调（P<0.05），GFAP、GABA B2 的表达上调（P<0.05）治疗后，MXZL 组与MXDZ 组比较：GLU-IR、GABA B2 的表达明显上调，GFAP 的表达明显下调（P<0.05），TMSGJL 组最为明显（P<0.05），见表4。

表4 PCR 法检测结果（）

4 采用western-blot 检测GLU-IR、GFAP、GABA B2的表达水平

JSSDZ 组与KBDZ 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），MXDZ 组、MXZL 组与JSSDZ 组、KBDZ 组比较明显升高（P<0.05），经天麻素治疗后，上述指标MXZL 组与MXDZ 组比较明显下降，且TMSGJL 组下降最为明显（P<0.05），见图3。

图3 western-blot 法检测结果

讨论

中枢神经系统功能恢复的过程是代偿[9]，中枢功能状况可能与前庭功能障碍恢复密切相关[10]。随着技术的发展，学者对代偿的认识从假说已经发展到细胞分子水平，目前多数学者认为中枢代偿的基础是损伤后的神经元结构的再恢复，是经中枢神经系统（CNS）重组了各种信息[11]。研究已证实代偿的过程主要由前庭核、前庭核间连合纤维、小脑、网状结构、下橄榄核、舌下神经前置核等部位参与，其中以前庭内侧核最为重要，故将前庭内侧核作为本实验研究的部位。

天麻具有平抑肝阳、息风止痉、祛风通络的功效。《本草纲目》载：“天麻，乃肝经气分之药”，《素问》云：“诸风掉眩，皆属于肝”，罗天益言：“眼黑头旋，风虚内作，非天麻不能治。天麻乃定风草，故为治风之神药”。可见，天麻用于治疗眩晕，历史悠久且疗效显著。现代药理研究表明。天麻素是天麻的主要成分[12]，可透过血脑屏障[13]，到达其靶器官，即脑部。

谷氨酸免疫反应物（glutamate immunoreactive substance,GLU-IR）介导兴奋性神经传导[14]。单侧前庭损伤后两侧神经传导兴奋性出现差异，因而出现眩晕症状，有研究表明损伤侧GLU-IR 含量出现明显下降[15]。星形胶质细胞（giial fibrillary acid protein,GFAP）与前庭神经元执行正常功能密切相关，前庭功能受损时GFAP 反应增强[16，17]。GABA B2 参与多种神经活动，参与前庭功能急性损伤后的功能恢复[18]，其促前庭代偿功能起到改善眩晕症状的作用[19]。

本实验研究结果表明：①单侧前庭功能丧失，可造成患侧GLU-IR 表达下调，考虑原因为：GLUIR 是中枢神经系统中的兴奋性神经递质，当术侧前庭功能丧失后，术侧前庭神经失支配，因而兴奋性递质减少；GFAP 表达上调，考虑原因为：术侧前庭功能丧失导致星形胶质细胞肥大改变；GABA B2 表达上调，考虑原因为：术侧前庭功能丧失，大鼠自身的前庭及中枢代偿机制使GABA B2 表达上调；②天麻素能够起到促进前庭功能恢复及中枢代偿的作用，且高剂量天麻素效果更好。

本研究中大鼠应用天麻素的高、中、低剂量均为根据天麻素注射液的药品说明书中600 mg 1 次/d静点的剂量根据标准体重与大鼠的折算系数进行计算得出，经研究结果发现，治疗前庭性眩晕TMSGJL 组效果最好。因此或可提出假说，按照每公斤体重计算用药剂量的方案疗效或许较优，今后课题组会深入研究，拟探讨安全范围内，根据体重计算用药量，以增加临床疗效。