响应面法优化豆粕肽制备工艺

刘静波，王子秦，于一丁，张 婷，刘博群*

（1 吉林大学 吉林省营养与功能重点实验室 长春 130062 2 吉林大学食品科学与工程学院 长春 130062）

大豆粕是大豆经过压榨提取油脂后的副产品，其蛋白质含量随大豆品种与产地的不同而有所不同[1]。由于大豆粕中的蛋白分子质量较大，禽消化率仅为80%～85%[2]，因此造成蛋白质资源的大量浪费，加剧了蛋白质资源日益紧缺的局面。如何挖掘豆粕的潜力，提高消化利用率，尤其是将豆粕转化为肽类或功能性肽类已成为目前研究的热点。

豆粕肽是豆粕水解后产生的分子质量小于10 ku 肽类物质[3]，除易于吸收外，还具有抗癌活性[4]、改善睡眠[5]、降血压[6-7]、抗氧化[8-9]、降胆固醇[10]、抗菌消炎[11-12]、调节血糖[13]等生物活性。豆粕肽的制备方法主要有酸水解[14]、酶水解[15-20]、生物发酵[21-22]及菌酶协同发酵[23]。酶解法是目前最常用的方法，酶水解条件温和，易于控制，选用复合风味蛋白酶可以把处于肽键末端的疏水性氨基酸水解掉，降低豆粕肽苦味，提高人们对豆粕肽制品的接受度。

在前人研究的基础上，本文以豆粕为原料，采用复合风味蛋白酶优化工艺参数，以期制备较高产率且苦味较低的豆粕肽产品，为豆粕原料深加工提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂大豆粕，长春市华程生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（1.1×104U/g），广西南宁杰沃生物制品有限公司；胃蛋白酶（酶活2.5×104U/g）、胰蛋白酶（酶活0.3×104U/g），Sigma 公司；复合风味蛋白酶（酶活500 LAPU/g）、中性蛋白酶（酶活1.5 AU/g），诺维信公司；马尿酸（98%）、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸，北京化工厂；乙腈、甲酸（色谱纯级），美国Fisher Scientific 公司；定氮催化片，北京粮食科学研究所；三氯乙酸（分析纯级），天津北联精细化学品开发有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

STARTER 3100 实验室pH 计，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SynergyHT 酶标仪，BioTek；CR20B2 高速冷冻离心机，日立公司；XX8200230小型切向流超滤系统，Millipore 公司；JJ-1 精密定时电动搅拌器，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；FD-1A-50 冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；DG-800 漩涡混合器，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；K1100 全自动凯氏定氮仪，海能仪器有限责任公司；恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆粕中蛋白质的含量测定 称取豆粕约0.5 g，采用凯氏定氮法测定豆粕中蛋白质的含量。按公式（1）计算：

式中，X——样品（豆粕）中蛋白质的含量，g；V1——样品消耗盐酸滴定液（0.05 mol/L）的体积，mL；V2——空白消耗盐酸滴定液（0.05 mol/L）的体积，mL；m——样品的质量，g。

1.3.2 豆粕肽的制备 将脱脂大豆粕粉碎过60目筛，称取4 g 放入锥形瓶中，加水100 mL 溶解，磁力搅拌15 min，置恒温水浴锅中。用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH 值，设定适当温度，添加定量的蛋白酶，水解一定时间后，进行灭酶操作（90 ℃，10 min），将酶解液冷却至室温后，进行离心处理（4 000 r/min，10 min），保留上清液供后期分析。

1.3.3 豆粕肽得率测定 取上清液5 mL，加入等量的10%三氯乙酸溶液，混匀后静置10 min，离心分离（4 000 r/min，20 min），用BCA 试剂盒测定上清液中豆粕肽质量浓度（g/mL）。按公式（2）计算：

式中：N1——上清液中豆粕肽质量浓度，g/mL；V——稀释体积，mL；m——豆粕质量，g。

1.3.4 水解蛋白酶的筛选 以豆粕肽得率为指标，考察复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶5 种酶在各适宜的条件下（见表1）酶的水解活性，确定最佳蛋白酶的类型。

表1 5 种蛋白酶最佳酶解温度和最适pH 值表Table 1 Optimum hydrolysis temperature and optimum pH value of five proteases

1.3.5 单因素实验 在底物质量浓度4 g/100 mL、酶解时间7 h、酶解温度50 ℃、加酶量0.8%条件下，考察酶解pH 值（4，5，6，7，8，9）对肽得率的影响。

在底物质量浓度4 g/100 mL、酶解时间7 h、酶解pH=6、加酶量0.8%条件下，考察酶解温度（35，40，45，50，55，60 ℃）对肽得率的影响。

在酶解时间7 h、酶解温度50 ℃、酶解pH=6、加酶量0.8%条件下，考察底物质量浓度（1，2，3，4，5，6 g/100 mL）对肽得率的影响。

在底物质量浓度4 g/100 mL、酶解时间7 h、酶解pH=6、酶解温度50 ℃条件下，考察加酶量（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%）对肽得率的影响。

在底物质量浓度4 g/100 mL、酶解pH=6、酶解温度50 ℃、加酶量0.8%条件下，考察酶解时间（4，5，6，7，8，9 h）对肽得率的影响。

1.3.6 响应面优化试验 在单因素实验基础上，应用Box-Behnken Design 进行响应面优化试验（三因素三水平），因素与水平的具体参数见表2。

表2 响应面设计因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.3.7 感官评定 按GB/T 12312-2012 《感官分析味觉敏感度的测定方法》 分别配置结晶咖啡因质量浓度为：0.06，0.07，0.09，0.11，0.14，0.17，0.22，0.27 g/L 的（等比比率R=0.8）溶液，设5 个人组成的感官评定小组。根据8 个苦味等级打分：0分-完全不苦，1 分-几乎无苦味，2 分-刚好可尝到苦味，3 分-微苦，4 分-中等苦味，5 分-带稍许强烈苦味，6 分-有强烈的苦味，7 分-非常强烈的苦味[24-26]。

2 结果与分析

2.1 豆粕中蛋白质的含量测定结果

经测定，豆粕中蛋白质含量为34.68%。当pH为7 时，按1.3.3 节方法测定未经蛋白酶水解过的豆粕中可溶性小肽含量为1.82%，说明豆粕中可溶性小分子肽含量较少。

2.2 蛋白酶的筛选

由图1a～d 可知，中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶随着加酶量增大、酶解时间延长，豆粕肽得率明显上升，且复合风味蛋白酶在酶解时间为7 h，加酶量为1.0%条件下豆粕得率最高。由图1e 可知，胃蛋白酶对豆粕肽得率的影响不显著，且得率偏低。故选择复合风味蛋白酶作为最优水解酶。

图1 酶解条件对酶解豆粕肽得率的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.3 单因素实验结果

2.3.1 pH 值对肽得率的影响 由图2所示，当酶解pH 值为6～7 时，豆粕肽得率较高，这是由于溶液pH 值是决定蛋白酶催化活性的主要参数之一。一方面pH 值会改变试验底物的解离状态，影响其与蛋白酶的结合；另一方面，过酸过碱的试验环境，还可改变蛋白酶的空间构象，导致蛋白酶失活[27]，故酶解pH 值确定为6.5 左右。

图2 酶解pH 值对酶解豆粕肽得率的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis of pH value on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.3.2 酶解温度对肽得率的影响 由图3所示，当酶解温度45～55 ℃时，豆粕肽得率较高。适当的升温可以通过酶的催化作用提高豆粕肽得率，然而温度过高会导致酶失活，故酶解温度值确定为50 ℃左右。

图3 酶解温度对酶解豆粕肽得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.3.3 底物质量浓度对肽得率的影响 由图4所示，当底物质量浓度4.0 g/100 mL 左右时，豆粕肽得率较高。这是由于随着底物质量浓度的增加，酶解速度加快，但底物质量浓度过高时，一方面大量底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子；另一方面高质量浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而影响豆粕肽得率，故酶解底物质量浓度确定为4 g/100 mL。

图4 底物质量浓度对酶解豆粕肽得率的影响Fig.4 Effect of enzymatic substrate concentration on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.3.4 加酶量对肽得率的影响 由图5所示，当加酶量0.9%～1.1%时，豆粕肽得率较高。随着加酶量的增加，豆粕肽得率呈现不断上升的趋势；当加酶量达到1.0%时豆粕肽得率增长趋于平缓。为降低成本，故加酶量为1.0%左右。

图5 加酶量对酶解豆粕肽得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis of enzyme concentration on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.3.5 酶解时间对肽得率的影响 由图6所示，当酶解时间7 h 时，豆粕肽得率较高。随着时间的延长，肽得率随之升高，超过7 h 后，趋于平缓甚至下降，故酶解时间确定为7 h 左右。

图6 酶解时间对酶解豆粕肽得率的影响Fig.6 Influence of enzymatic hydrolysis time on yield of soybean meal peptide by enzymatic hydrolysis

2.4 响应面法优化试验结果

2.4.1 响应面试验设计及回归模型的建立 以单因素实验结果为基础，以酶解时间（A）、加酶量（B）、底物质量浓度（C）3 个因素为相应变量，以肽得率为响应值（Y），设计三因素三水平试验17 组，结果见表3。

对表3进行回归分析，回归方程如下：

表3 试验方案和结果Table 3 Experimental scheme and results

Y=-21.60038+5.46488A+12.43150B+3.77038C-0.34750AB-0.021250AC-0.0075BC-0.35325A2-4.60200B2-0.44450C2。

对回归方程进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验Table 4 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models

由表4可知，回归模型P＜0.001，说明该模型极显著；一次项中，B 影响显著，A、C 影响不显著，说明单因素中加酶量对豆粕肽得率影响更显著。根据F 值大小，可以判断3 个因素对豆粕肽得率影响的主次顺序为加酶量（B）＞酶解时间（A）＞底物质量浓度（C）；相互作用项AB 显著（P＜0.05）；失拟项不显著（P=0.4745＞0.05），R2=0.9481 说明回归方程拟合度好，该模型成立，可进行分析和预测。

2.4.2 各因素之间交互作用对豆粕肽的率的影响 由图7可知，加酶量与酶解时间的交互作用较强，与表4的方差分析中显著性检验结果一致。

图7 各因子交互作用的等高线图和曲面图Fig.7 Contour maps and surface maps for each factor interaction

2.4.3 响应面优化验证 响应面优化最优条件：酶加量1.08%，酶解时间6.95 h，底物质量浓度4.06 g/100 mL，豆粕肽得率预测值为（12.42±0.06）%。为验证预测的准确性，考虑到实际操作的方便和经济效益，确定最优制备条件：酶加量1%，酶解时间7 h，底物质量浓度4 g/100 mL，酶解温度50 ℃，酶解pH 6.5。该条件下经过3 次平行试验，测得豆粕肽得率为12.63%，与理论预测值基本吻合，说明响应面分析法对豆粕肽制备条件优化是可行的。

2.5 感官评定结果与分析

对得到的酶水解上清液经感官评定小组评定，分值为：1，1，1，0，1 分，均值为0.8 分，说明复合风味蛋白酶酶解制备的豆粕肽液几乎无苦味。刘大川等[28]的试验表明，复合风味蛋白酶含有外切酶，能将处于肽键末端的多种疏水性氨基酸水解出来，因而会降低多肽的苦味，从而提高消费者对豆粕肽加工制品的接受度。

3 结论

本研究结合感官评定技术、采用响应面分析方法优化豆粕肽工艺参数，获得了苦味低且豆粕肽得率较高的制备方法。工艺简单，酶用量较少，酶解时间较短，符合大规模生产要求，为豆粕资源的开发利用提供了数据支持与参考。