基于网络药理学探讨化聚消积方治疗糖尿病肾病的作用机制

刘瑶萍，张 曾，范朝华，王文健，杨宏杰，何燕铭

(1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437；2. 上海市中医药研究院中西医结合临床研究所，上海 200083)

糖尿病肾病是2型糖尿病危害最重的并发症之一，与血糖、血脂控制欠佳，吸烟，氧化应激，糖基化终末产物的积累，环境和遗传等因素密切相关。胰岛素抵抗在2型糖尿病及糖尿病肾病的发病机制中起关键作用。中医认为胰岛素抵抗的病机是气聚不化，湿热内蕴，血瘀阻滞，属“聚证”范畴，益气化聚方则是基于治疗 “聚证”的思想创制而成[1]。方中黄芪甘温，补中益气，提升脾气以推动枢机，促进气化以利游溢、布散精气；蒲黄散积聚，化瘀血；黄连清热、泻火、燥湿，去湿热之邪；茵陈清湿邪，解热滞。诸药合用，使气化恢复，痰浊、湿热、瘀血消散，精微物质能够正常化生、布散。临床研究发现，该方可有效改善肥胖、代谢综合征、非酒精性脂肪肝等疾病[2-4]。在此基础上，课题组在益气化聚汤中药配伍中加入温肾清利消积中药附子、六月雪、积雪草，组成了化聚消积方，其中附子辛甘热，归肾经，温阳补肾；六月雪、积雪草清热利湿。临床及动物实验证实化聚消积方可减少2型糖尿病肾病的尿微量白蛋白[5-6]。本研究借助网络药理学方法挖掘化聚消积方的主要活性成分及可能的作用靶点，探讨化聚消积方干预糖尿病肾病可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1化聚消积方成分及靶点筛选 化聚消积方由黄芪30 g、黄连10 g、蒲黄15 g、茵陈15 g、积雪草15 g、六月雪15 g、附子9 g构成。利用TCMSP平台(http://tcmspw.com/index.php)和BATMAN数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)完成化聚消积方中5个中药有效成分搜索，再根据所有化合物的口服生物利用度(OB)和类药性(DL)进行筛选，筛选标准来自TCMSP的推荐值OB≥30%；DL≥0.18。经筛选后的化合物，显示其对应的靶点备用。

1.2糖尿病肾病疾病靶点筛选 利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://omim.org/)来获取糖尿病肾病的靶点。运用主题词Diabetic Nephropathy(主题词来自MeSH)进行搜索。

1.3构建蛋白相互作用网络 将化聚消积方的靶点与糖尿病肾病靶点取交集后，结果输入STRING数据库，选择人源性靶点，得到关于化聚消积方治疗本研究疾病的蛋白互作网络(简称PPI网络)，有助于从系统角度全面探索疾病的分子机制。再将STRING数据库的结果文件，使用R语言计算各蛋白之间的连接次数，得到连接次数最多者即PPI网络中的核心靶点。

1.4关键化合物 使用R语言计算化合物对应靶点的个数，对应个数越多者即关键化合物。并标注化合物在本复方中的中药来源。

1.5核心靶点及关键化合物相互作用网络 利用Cytoscape软件，将选出的核心靶点与核心化合物(数量依据筛选后得到有效化合物总数量的25%)形成互相作用网络。

1.6靶点注释 利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点进行注释。UniProt数据库由整合Swiss-Prot、 TrEMBL和PIR-PSD三大数据库的数据而成。它的数据主要来自于基因组测序项目完成后，后续获得的蛋白质序列，包含了大量来自文献的蛋白质的生物功能的信息。

1.7富集分析 从基因功能和信号通路2个层面，分别利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)进行富集分析。两种分析结果均使用R语言中ClusterProfiler包[7]计算，显著性以P<0.05为检验水准，再使用EnrichPlot包对数据进行可视化。通路图可视化结果使用Pathview包。

2 结 果

2.1化聚消积方化合物及靶点筛选结果 经数据库检索，得到黄芪87个、黄连48个、蒲黄33个、茵陈53个、积雪草69个、附子65个、六月雪20个化合物成分。经筛选，得到符合条件的候选化合物共82个，对应作用靶点212个。

2.2疾病靶点 搜集关于糖尿病肾病的靶点有3 082个，经剔除综合评分5分以下的靶点后，得到1 170个靶点。

2.3PPI网络构建 药物靶点与疾病靶点经对照处理后，得到105个交集靶点。交集靶点结果输入STRING数据库后，得到关于本疾病的PPI互作网络图，见图1。再利用R语言得到本网络的核心靶点结果(见图2)，IL6以87次的连接次数位于本网络的首位，是本网络中最关键的靶点，AKT1、VEGFA、CASP3、PTGS2等依次在后。

图1 化聚消积方PPI网络

图2 化聚消积方PPI网络核心靶点前30位

2.4核心化合物 交集靶点共对应41个化合物，表1里展示对应靶点数量前10位的化合物。附子所含的化合物成分，未排在前10位中，故单独分析附子的化合物成分与靶点的对应关系，得到结果见图3(橙色标签表示化合物，蓝色标签表示靶点)，可以看到附子有4个有效成分对应了核心靶点之一的PTGS2。

图3 附子的化合物与靶点对应网络

表1 化聚消积方前10位核心化合物

2.5核心靶点——关键化合物互作网络 选取前15位核心靶点和对应靶点数量前10位化合物，利用Cytoscape软件展示它们之间的互作网络，见图4(橙色标签表示化合物，蓝色标签表示靶点)，可以看到Quercetin/槲皮素与核心靶点的对应数量也是最多的，PTGS2则是来源化合物数量最多的核心靶点。

图4 核心靶点—关键化合物互作网络

2.6富集分析

2.6.1GO功能分析 生物过程(BP)共得到2 008条富集结果(P<0.05)，主要包括细胞对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、活性氧代谢过程、对氧化应激的反应等。分子功能(MF)共得到143条富集结果(P<0.05)，主要包括细胞因子受体结合、类固醇结合、磷酸酶结合、核受体活性、细胞因子活性、类固醇激素受体活性等。细胞组成(CC)共得到36条富集结果(P<0.05)，主要包括 膜筏、膜区、膜微区、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合体等。每个过程取前10条结果以气泡图展示，圆圈的大小表示基因富集的数量，同样颜色由红变蓝表示P值逐渐增大，见图5。对于生物过程(BP)，将P值由小到大前30个词条的基因富集结果以点阵图的形式展现(按纵轴从原点起P值由小到大排列)，可以直观地看出每个生物过程中富集的具体基因，有助于进一步探索发现基因间的相互联系，见图6。

图5 GO分析结果

图6 GO生物过程富集基因点阵

2.6.2KEGG通路分析 结果显示共有154条通路(P<0.05)，涉及面广泛，取排名前20条结果，依次是：流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、甲型流感、癌症中的蛋白聚糖、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、恰加斯病(美国锥虫病)、丙型肝炎、前列腺癌、内分泌抵抗、弓形虫病、胰腺癌、利什曼病、疟疾、膀胱癌，见图7。使用Pathview包对糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路进行可视化，见图8，可以看到红色标签的基因表示化聚消积方中的靶点对该通路的上调结果。

图7 KEGG通路分析前20结果

图8 化聚消积方对AGE-RAGE信号通路上调结果

3 讨 论

中医理论中有“异病同治，同病异治”一说，正如不同的疾病中可存在相同的通路机制，不同的通路机制可作用于同一疾病，与网络药理学的分析方法不谋而合。为整体系统地分析探讨中药复方的作用机制提供研究思路。

化聚消积方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸。研究发现槲皮素可通过SCAP-SREBP2-LDLr信号通路改善早期糖尿病肾病的脂质代谢以减轻早期肾脏损害[8]。槲皮素还可通过Hippo通路抑制早期糖尿病肾病的系膜细胞增殖[9]。山奈酚可抑制2型糖尿病小鼠的TNF-α-p38MAP激酶信号通路对肾脏起保护作用[10]。花生四烯酸是细胞膜脂质的主要成分，主要由环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450酶代谢。基于这3种代谢途径，花生四烯酸可以转化为多种触发不同炎症反应的代谢物，在炎症过程中对肾脏的损害中也起着至关重要的作用，如对肾小管上皮细胞的损伤[11]。

核心靶点IL-6，是一种多效细胞因子，在免疫、组织再生和代谢中起作用。2型糖尿病患者血清IL-6水平升高，IL-6和sIL-6R损害了跨不同细胞系的体外内皮细胞功能，可能对2型糖尿病相关的微血管并发症有影响[12]。在一项关于IL-6多态性的荟萃分析中发现[13]，IL-6 rs1800795，rs1800796和rs1800797在糖尿病肾病的发展中起着重要作用。PTGS2又称COX2，环氧合酶(COX)是负责前列腺素合成的限速酶，其存在两种同工型： COX1和COX2。在某些组织中诸如内皮，肾脏，大脑和肿瘤细胞等中表达，与细胞黏附增加，表型改变，对细胞凋亡的抗性和肿瘤血管生成有关。在胰岛素抵抗中COX2介导信号具有双重效应[14]。其他作用靶点，如AKT1、VEGFA、CASP3等，也都在胰岛素抵抗，肾小球微血管病变，调控细胞凋亡等方面与糖尿病肾病关系密切[15-17]。

KEGG通路分析发现，化聚消积方治疗糖尿病肾病可能与糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗的经典通路之一MAPK信号通路、炎症因子相关的TNF信号通路、IL-17信号通路有关。糖基化终末产物(AGEs)是细胞衰老过程中的危险分子，这些终产物在糖尿病中越来越多地合成，并且与糖尿病并发症密切相关。它们积聚在细胞外基质中，产生氧化应激和炎症。在微血管病变方面，引起肾脏的损伤[18]。化聚消积方可能作用于AGE-RAGE信号通路，减少糖基化产物，减轻肾脏损伤。研究发现，NRG4可通过TNF-R1信号可减弱糖尿病肾病中AGEs的表达，对糖尿病肾病中的肾小管间质纤维化具有治疗作用[19]。提示化聚消积方也可能通过TNF信号通路，改善糖尿病肾病损害。

综上所述，化聚消积方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸等。PPI网络显示化聚消积方中核心靶点有IL6、AKT1、VEGFA等。KEGG通路显示存在AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。它们之间存在着复杂的，多层次的作用网络，提示化聚消积方在治疗糖尿病肾病方面机制的多样性，将为今后开展动物及临床试验提供可靠依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。