血清外泌体癌胚抗原检测作为肝癌和胆管癌诊断指标的临床应用

苗 辉

河南省郑州市第三人民医院检验科 450000

原发性肝癌是一种临床上常见的恶性肿瘤，其主要包括肝细胞癌及肝内胆管细胞癌，该病的发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，临床上多采取影像学方法诊断肝癌和胆管癌等疾病，但由于肝癌和胆管癌的影像学表现均为肝内占位，但肝癌和胆管癌的治疗方式及预后均不同，因此在选择治疗方法时应对患者疾病类型进行鉴别诊断，以选择适合的治疗方案。由于肝癌和胆管癌起病较隐匿，早期无特异性临床表现，很难在早期发现疾病，因此需选择一种有效的诊断方法。

近年来，肿瘤标志物已成为诊断恶性肿瘤的主要方法。血清肿瘤标志物是机体在癌细胞产生及增殖中与癌细胞反应时产生，肿瘤标志物检测具有无创、灵敏性高及诊断效果好等优势，早期即可在患者血清中检测到[2]。相关研究发现，肿瘤标志物血清癌胚抗原与肝癌的诊断具有相关性[3]。但血清CEA水平对肿瘤早期诊断的敏感性稍差。外泌体包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡，广泛存在于机体的血细胞、肿瘤细胞等细胞中的囊泡样结构，在机体处于生理或病理状态时大量释放，由于外泌体中含有受体、蛋白及核酸等，故外泌体能够向受体细胞传递遗传信息。研究表明，外泌体内的许多蛋白可对肿瘤进行早期诊断[4]。鉴于此，本文探讨血清外泌体CEA检测在肝癌和胆管癌鉴别诊断中的价值，具体如下。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取2018年3月—2019年3月就诊于我院的30例胆管癌患者作为胆管癌组，选取30例肝癌患者作为肝癌组，另选取同期30例健康体检者作为对照组。胆管癌组中男16例，女14例；年龄38～75岁，平均年龄(55.42±5.33)岁。肝癌组中男17例，女13例；年龄39～76岁，平均年龄(55.53±5.45)岁。对照组中男16例，女14例；年龄38～77岁，平均年龄(55.62±5.43)岁。本研究经医院伦理委员会批准并通过，且患者及其家属均签署了知情同意书。两组患者的基本资料经统计学比较后无显著差异性(P>0.05)。纳入标准：(1)符合第9版《中西医结合外科学》中疾病诊断者[5]；(2)经CT增强和磁共振检查证实者；(3)未接受药物和手术治疗者。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)精神异常者；(3)严重心律失常者；(4)合并血液及免疫系统疾病者。

1.2 方法 血清外泌体提取：将血清标本进行离心15min，设置转速为3 000r/min，去除残留细胞和细胞碎片，吸取250μl上清液到新管中，加入63μl ExoQuick试剂进行充分混匀，静置于室温下30min后进行离心30min，设置转速为1 500r/min，弃去上层清液后再次进行离心5min，设置转速为1 500r/min，弃上层清液后剩余沉淀为血清外泌体。(1)血清外泌体CEA检测：采用qRT-PCR法进行检测，去除残留细胞，血清样本使用封闭液选择PBS 缓冲液，稀释倍数为500倍，用100ml RIPA裂解液在冰上沉淀裂解30min，并进行振荡以充分混匀，继续稀释。在血清CEA抗体包被微孔板上加入稀释后的血清及外泌体样品100μl，于37 ℃条件下孵育1h，甩掉微孔板中的液体后拍干，加入A液，继续在37 ℃条件下孵育1h，连续洗板3次，加入B液，于37 ℃条件下孵育30min，连续洗板5次后加入90μl底物，于37℃条件下避光孵育15min，加入50μl终止液，在450nm波长下进行测定。(2)血清CEA水平检测：采集受试者空腹静脉血5ml，置于真空采血管中，于25℃条件下沉淀30min，使用离心机进行离心10min，设置转速为4 000r/min，将真空采血管置于-25℃冰箱中进行保存。采用化学发光免疫分析法检测血清CEA水平。严格按照试剂盒说明书进行操作。阳性判断标准：CEA>3.4μg/L为阳性[6]。

2 结果

2.1 各组的血清CEA水平比较 肝癌组、胆管癌组的血清CEA水平明显高于对照组，且肝癌组的血清CEA水平明显高于胆管癌组，比较有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组的血清CEA水平比较

2.2 各组的血清外泌体CEA水平比较 肝癌组的血清外泌体CEA水平明显高于胆管癌组和对照组，比较有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组的血清外泌体CEA水平比较(pg/ml)

2.3 血清CEA水平和血清外泌体CEA的诊断效能比较 肝癌组的血清外泌体CEA曲线下面积明显高于血清CEA，比较有统计学差异(P<0.05)；胆管癌组的血清外泌体CEA曲线下面积明显高于血清CEA，比较有统计学差异(P<0.05)；肝癌组的血清外泌体CEA、血清CEA曲线下面积均明显高于胆管癌组，比较有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 血清CEA水平和血清外泌体CEA的诊断效能比较

3 讨论

肝癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，死亡率较高，患病后严重影响患者生命健康[7]。以往临床多采用影像学方法进行诊断，但易出现漏诊，影响患者选择治疗方案并延误患者的最佳治疗时机[8]。肿瘤标志物检测是一种肿瘤早期筛查手段，但目前尚未发现符合肝癌诊断的肿瘤标志物。研究表明，在多数恶性肿瘤患者血清中能够检测大量血清CEA[9]。血清CEA是由肿瘤组织产生的一种肿瘤标志物，在多数肿瘤患者血清中含量显著升高，但血清CEA水平升高也有可能预示患者治疗后的复发或转移，因此对恶性肿瘤的诊断敏感性较低。研究表明，血清外泌体参与肿瘤的发生发展，由于外泌体中所含的蛋白质、核酸等能够反映来源细胞的特征和状态，所以血清外泌体可能为肿瘤早期诊断的标志物[10]。研究显示，不同肿瘤患者血清中外泌体CEA含量不同[11]。因此，为鉴别肝癌与胆管癌，本文检测患者血清外泌体中CEA水平。本文结果显示，肝癌组的血清外泌体CEA水平明显高于对照组(P<0.05)；肝癌组的血清外泌体CEA曲线下面积明显高于血清CEA，且肝癌组的血清外泌体CEA、血清CEA曲线下面积均明显高于胆管癌组(P<0.05)。本研究数据与刘万超等[12]的结论基本一致。结果说明：血清外泌体CEA对肝癌和胆管癌的诊断效能优于血清CEA，且肝癌患者的血清外泌体CEA水平显著高于胆管癌，可作为鉴别诊断的指标。分析原因可能为：(1)正常人血清外泌体CEA经胃肠道进行代谢，因此血清外泌体CEA水平较低；但肿瘤患者的血清外泌体CEA经血液和淋巴循环，由于功能受阻，进而导致血清外泌体CEA水平明显升高[13]。(2)在肿瘤发生、发展过程中，肿瘤细胞排列极性消失，患者血清中CEA水平呈阳性[14]。(3)肝癌患者的肝脏功能较差，肝细胞的摄取、代谢能力下降，肝内血液分流致使CEA直接入血，血清CEA增加，且高于肝胆癌。因此血清CEA水平可作为肝癌和胆管癌的诊断指标[15]。

综上所述，血清外泌体CEA对肝癌和胆管癌的诊断效能优于血清CEA，且肝癌的血清外泌体CEA水平高于胆管癌，血清外泌体CEA可作为肝癌和胆管癌鉴别诊断的有效指标，值得在临床推广。