基于“五原则”的血必净注射液质量标志物的预测分析*

蔡楠，曹宁宁，赵利斌，3，裴帅，李晓璇，张琬靖，肖学凤，刘昌孝

（1.天津中医药大学中药学院，天津 301617；2.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津 300410；3.北京振东光明药物研究院，北京 100085；4.天津药物研究院释药技术与药物代谢动力学国家重点实验室，天津 300301）

中药质量是中药临床安全有效的基础，是中药产业发展的生命线[1]。中药质量标准和质量控制关系到中医药科学和产业发展的国家战略问题[2]。但现行质量标准主要以成分定性鉴别和定量分析为评价方法，虽然部分品种进行了较为系统的化学成分研究，但指标成分选择往往缺乏特有性、有效性、溯源性等依据，不能充分保障中药及产品的临床疗效和安全性，质量不能有效追踪溯源。为此，2016 年，刘昌孝院士提出了中药质量标志物（Q-marker）的核心概念和理论，引起了同行学者高度关注。Qmarker 的研究思路着眼于全过程基础物质的特有、差异、动态变化以及质量的溯源性来建立中药全程质量控制，以提高中药质量控制的针对性和指向性[3]。概而言之，Q-marker 研究应基于有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”而确定，完善现行质量标准中的诸多不足，保证临床用药的有效性和安全性。

血必净注射液是由中国危重病急救医学的奠基人和开拓者王今达教授历经30 年研制成功的中药复方制剂，其由红花、赤芍、川芎、丹参和当归5 味中药组成[4]。方中红花活血散瘀止痛为君药；赤芍凉血化瘀，川芎活血止痛，两者共为臣药；当归养血活血，丹参活血祛瘀，清心除烦，两者共为佐药[5]。全方配伍既可活血化瘀，又可行气养血，具有化瘀解毒之效。主治发热、喘促、心悸、烦躁等瘀毒互结症，临床多用于治疗因感染诱发的全身炎症反应综合征，或配合治疗多器官功能失常综合征的脏器功能受损期[6]。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发后，在没有特效药和疫苗的情况下，以中医药辨证施治、多靶点干预为基础，筛选出包括血必净注射液在内的一批有效方药。血必净注射液为国家卫生健康委员会颁布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》中推荐用药，其临床应用广泛，疗效确切，改善COVID-19 和重症肺炎感染患者发热、咳嗽及呼吸困难等临床症状[7-8]。血必净注射液可降低重症型COVID-19 患者体温，通过降低白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和C 反应蛋白（CRP）水平以减轻炎症反应，下调血清中D-二聚体水平而抑制血小板黏附和聚集，改善微循环，显著缩短核酸转阴时间，对COVID-19 有明显疗效[9]。血必净注射液能够调节重症肺炎患者血清中CD3+、CD4+和CD8+含量而增强免疫功能，促进肺部炎症的消除；升高动脉血氧分压（PaO2）和动脉血氧分压与吸入氧浓度比值（PaO2/FiO2），并降低动脉血二氧化碳分压（PaCO2）来维持动脉血气指标平衡，减轻患者肺部体征，有效治疗重症肺炎[10]。目前，血必净注射液研究主要集中在临床应用方面，其质量控制方面尚有欠缺。为保证临床用药的安全性和有效性，本文在梳理现代研究文献基础上，依据Q-marker“五原则”，对血必净注射液Q-marker 的确定进行分析与论证，预测血必净注射液的Q-marker，以期为血必净注射液的后续临床及其质量控制研究提供参考依据。

1 基于质量传递与溯源的Q-marker 预测分析

中药化学成分是其功效表达的物质基础，是反映中药质量的客观实质。因此，中药质量控制应着眼于中药形成的全过程，建立基于质量传递与溯源的全程质量控制体系[11]，保证中药临床的有效性。血必净注射液化学成分复杂，目前对其单味药材化学成分研究较多。采用质谱法从血必净注射液的5 味药材中共鉴别出170 余个化合物[12-33]，其中从红花中辨识27 个化合物，赤芍中辨识59 个化合物，川芎中辨识35 个化合物，丹参中辨识53 个化合物，当归中辨识27 个化合物。

由于各单味药材在经提取纯化等制备工艺制成中药复方制剂的过程中，既有有效性成分的获取，又有去粗取精、去伪存真的过程，因此，中药复方制剂中的化学成分是其质量控制的主要指标，其上溯药材源头，下延体内的最终效应成分。已有研究采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱方法，对血必净注射液化学成分进行表征和辨识，从血必净注射液中共辨识80 余个化合物，其中从红花中辨识13 个化合物，赤芍中辨识24 个化合物，川芎中辨识27 个化合物，丹参中辨识27 个化合物，当归中辨识24 个化合物[34]。

中药复方制剂的有效成分首先入血，再通过血液运输到达疾病治疗靶点发挥治疗作用，因此，入血成分才是最终的“效应成分”。从质量传递与溯源的角度，血中的效应成分是质量传递体系的最终环节，也是中药质量标志物确定的重要依据。采用液质联用方法，快速分析和辨识静脉注射血必净注射液后临床患者和大鼠的入血成分[35-41]。静脉注射血必净注射液后从临床患者和大鼠血浆中共辨识出30 余种入血成分，其中从红花中辨识5 个化合物，赤芍中辨识12 个化合物，川芎中辨识11 个化合物，丹参中辨识7 个化合物，当归中辨识7 个化合物。

综上，通过对血必净注射液原药材、血必净注射液及其入血成分的系统辨识，进一步将血必净注射液中成分及其入血成分进行对比归类，发现血必净注射液32 个入血成分均可溯源到血必净注射液及其单味药材中，结果见开放科学（资源服务）标识码（OSID），并明确其变化规律，见图1。因此，以具有溯源性的32 个入血成分可作为血必净注射液的Q-marker。

图1 血必净注射液中化学成分变化示意图Fig.1 Schematic diagram of chemical components change in Xuebijing Injection

2 基于成分特有性的Q-marker 预测分析

一个好的质量评价方法应具有对特定药材的针对性和专属性，以免“以假乱真”。中药复方特有性成分大多来源于单味药材的活性成分，其特征为含量高、具有与复方临床应用相关的药理作用等。血必净注射液具有抗炎、保护血管内皮细胞、抗凝血等药理作用，临床多用于治疗因感染诱发的全身炎症反应综合征。故本研究通过分析血必净注射液各单味药材中含量高且具有抗炎、保护血管内皮细胞、抗凝血等药理作用的化学成分，预测血必净注射液具有特有性的Q-marker。

2.1 红花成分的特有性分析 红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，主要含黄酮、酚酸类、生物碱等化学成分[42]。其中以羟基红花黄色素A 为主的黄酮类成分是红花主要成分，也是其他植物中较少见的成分。其不仅含量高，还具有抗炎、抗凝血等药理作用，故羟基红花黄色素A 可作为红花的特有性成分。

2.2 赤芍成分的特有性分析 赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora PalL 或川赤芍Paeonia veitchii Lynch 的干燥根，主要含单萜及其苷类、黄酮类和酚酸类等化学成分。其中芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷等单萜及其苷类成分具有保护血管内皮细胞、抗炎等药理作用，是赤芍的特征性成分[43-44]。因此，以芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷作为赤芍的特有性成分。

2.3 川芎、当归成分的特有性分析 川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。川芎和当归化学成分重叠度极高，两者均含有苯酞类、多糖类、有机酸类等成分，难以从化学成分将两者区分，故未单独分析川芎或当归的特有性成分，而是寻找当归和川芎共同区别于血必净注射液中其他药材的特有性成分。血必净注射液中川芎和当归共有成分为藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯G、洋川芎内酯H、洋川芎内酯N等苯酞类成分，是区别于血必净注射液中其他药材的特有性成分[45]。因此，藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯G、洋川芎内酯H、洋川芎内酯N 可作为血必净注射液中当归和川芎的特有性成分。

2.4 丹参成分的特有性分析 丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，主要含有酚酸类和丹参酮类成分。其中丹参酮类成分包括隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，但由于丹参酮类成分的药理作用为抗氧化、抗肿瘤等，与血必净注射液临床治疗因感染诱发的全身炎症反应综合征无关，故其不能作为丹参的特有性成分[46-47]；而酚酸类成分中90%以上是丹酚酸B，同时丹酚酸B 也是丹参中含量最高的成分，其经水解等反应主要生成丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、迷迭香酸等，且上述成分具有与血必净注射液临床治疗因感染诱发的全身炎症反应综合征相关的抗炎、抗凝血、保护血管内皮细胞等药理作用，可作为丹参的特有性成分[48]。文献报道，李伟等[49]和杨静等[50]预测含有丹参的中成药的Q-marker 为酚酸类成分丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A 和丹酚酸B。因此，丹酚酸B、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A 可作为丹参的特有性成分。

3 基于成分与药效关联的Q-marker 预测分析

质量控制的根本目的是对中药有效性的控制，有效性体现中药的“物质基础”作用人体疾病主体的不同层面、不同方式的生物效应表达形式，而有效性成分是阐释中药的药效物质基础、作用原理以及配伍规律、指导临床实践的重要依据和研究路径，将有效性成分纳入中药质量评价，才能反映中药质量的完整性[51]。因此，“有效”是确定Q-marker的核心要素。现代药理学研究表明血必净注射液具有抗炎、调节免疫和保护血管内皮细胞等作用，临床多用于治疗肺炎等炎症性疾病。

研究发现，血必净注射液中的羟基红花黄色素A、丹参素、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、洋川芎内酯H和洋川芎内酯Ⅰ能降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6 和IL-8 等炎症因子及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶2（COX-2）等炎症相关酶的含量，表明上述成分具有抗炎作用，可增强血必净注射液对机体炎症的治疗作用[42-55]。丹酚酸B可增加高脂日粮饲养小鼠外周血及脾脏CD4+、CD19+细胞数量，减少CD8+细胞数量，调节机体免疫，从而协同抗炎作用[56]。羟基红花黄色素A、丹酚酸B、芍药苷和芍药内酯苷均能够提高内皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化和一氧化氮（NO）代谢产物含量，调节内皮素-1（ET-1）、NO 平衡，增强血必净注射液对血管内皮细胞保护作用，减轻炎症导致的血管内皮损伤[57-59]。

综上，羟基红花黄色素A、丹酚酸B、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、芍药苷、芍药内酯苷、丹参素、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷是血必净注射液发挥抗炎、调节免疫及保护血管内皮细胞作用的有效成分，可作为血必净注射液Q-marker 的筛选参考。

4 基于网络药理学对复方配伍环境的Q-marker预测分析

复方是中药临床应用较多的形式，同一味中药在不同复方中发挥的作用及其药效物质基础不尽相同，既体现在不同作用靶点、不同信号通路协同拮抗作用，又涉及吸收、代谢等体内过程的交互作用。因此，需针对具体疾病病因病机和治法治则，基于网络药理学，从复方配伍环境出发，根据中药临床运用时最终效应成分及其功效的临床表达形式，确定复方Q-marker 的配伍特点。

基于网络药理学，建立血必净注射液“药材-成分-靶点-疾病”网络，预测血必净注射液治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的Q-marker[60]。选取血必净注射液中包括黄酮类、单萜苷类、酚酸类等类型在内的36 个主要活性成分，采用TCMSP、PubChem、TargetNet 数据库预测447 个活性成分靶点，并在Genecards 数据库中挖掘259 个COVID-19疾病靶点。通过STRING10、DAVID 和KEGG 等相关数据库，预测血必净注射液治疗COVID-19 主要通 过 其 活 性 成 分 作 用 于PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、MAPK1、IL-2、IL-6 和IL-10 等靶点有关的IL-17 信号通路、甲型流感、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性肠病等通路发挥作用。从网络药理学角度，阐释血必净注射液多成分、多靶点、多途径治疗COVID-19 的科学内涵。此外，还发现血必净注射液36 个主要活性成分中有效成分综合评分最高的10 个活性成分是槲皮素、没食子酸、木犀草素、迷迭香酸、芦丁、山萘酚、绿原酸、丹参酮ⅡA、羟基红花黄色素A 和芍药苷，提示其是血必净注射液治疗COVID-19 的重要活性成分，可作为血必净注射液的Q-marker。

5 基于成分可测性的Q-marker 预测分析

Q-marker 能够为建立质量标准提供依据，因此，“成分的可测性”是确定Q-marker 的必要条件。由于中药化学成分复杂，质量评价不仅需要以某些成分的含量作为指标，还需对中药的整体“化学轮廓”进行研究。含量测定指标成分具有可测性，是质量评价最重要的指标，也是评价质量优劣和合格限度的“金指标”。指纹图谱作为一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，能较为客观地反映全方的物质基础和化学成分群的整体性与复杂性，可用于评价质量的一致性[61]，故本研究从含量测定和指纹图谱两个方面预测血必净注射液具有可测性的Q-marker。

首先通过含量测定预测血必净注射液中具有可测性的Q-marker，《中华人民共和国药典》“含量测定”项下绝大部分使用高效液相色谱（HPLC）法测定，未出现使用液质联用法测定含量，故本研究预测可用HPLC 法测定的血必净注射液的Q-marker。2020 年版《中华人民共和国药典》规定的红花、赤芍、丹参、当归、川芎的8 个含量测定指标成分羟基红花黄色素A、山柰素、芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹酚酸B 和阿魏酸均采用HPLC 法测定[62]，表明其8 个指标成分均具有可测性。但各指标成分含量测定色谱条件不同，不能采用《中华人民共和国药典》色谱条件同时测定血必净注射液中化学成分的含量。冀兰鑫等[63]建立同时测定血必净注射液中没食子酸、原儿茶醛、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 和丹酚酸B 的HPLC 法，李娣等[64]建立不同波长下同时测定血必净注射液中丹参素、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ的HPLC 法，两种方法简便、快速、准确，能有效控制血必净注射液的质量。综上，表明上述成分羟基红花黄色素A、山柰素、芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、阿魏酸、没食子酸、原儿茶醛、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 和丹参素具有可测性，可作为血必净注射液具有可测性的Q-marker。

其次根据指纹图谱预测血必净注射液中具有可测性的Q-marker。中药为多成分的复杂体系，多年来《中华人民共和国药典》一直采用1～2 个指标成分控制中药质量，这与中药所含化学成分复杂、发挥药效时多成分、多靶点协同作用的特性不甚吻合。为加强中药质量的整体控制，指纹图谱在《中华人民共和国药典》中的应用逐渐增加，从整体化学轮廓的角度评价中药质量概貌，结合含量测定，使中药质量可控性明显增强。采用HPLC 法建立10 批血必净注射液指纹图谱，相似度均大于0.90，标定18 个共有峰，经与对照品比对，共指认了6 个色谱峰，分别为原儿茶醛、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、丹酚酸B[65]，增加血必净注射液质量的整体可控性。故基于Q-marker“五原则”的可测性，从含量测定和指纹图谱两个方面预测血必净注射液中具有可测性的成分有羟基红花黄色素A、丹参素、山柰素、芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、没食子酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、原儿茶醛，可作为血必净注射液的Q-marker。

综上，基于Q-marker 的传递与溯源、特有、有效、复方配伍和可测的“五原则”，建立血必净注射液Q-marker 发现的研究路径，见图2。在血必净注射液Q-marker 预测分析中，发现不同原则下预测得到的血必净注射液Q-marker 有所差异，故选取与血必净注射液有效性密切相关、具有溯源性、可测性强、特有性好的羟基红花黄色素A、丹酚酸B、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 作为血必净注射液的Q-marker，具体信息见表1 及图3。

图3 血必净注射液Q-marker 分子结构信息Fig.3 Molecular structure information of Q-markers of Xuebijing injection

表1 血必净注射液的Q-marker 信息Tab.1 Information of Q-markers of Xuebijing Injection

图2 基于“五原则”的血必净注射液的Q-marker 发现的研究路径Fig.2 Research approach of Q-marker of Xuebijing injection based on“five principles”

6 结语

血必净注射液是中国唯一被批准治疗全身炎症反应综合征和多器官功能障碍的中药注射剂，但其未被《中华人民共和国药典》收录。2020 年版《中华人民共和国药典》规定了血必净注射液中5 味单药材的指标成分含量，但各单味药指标成分含量测定方法不尽相同。因此，本研究为保证血必净注射液的临床用药安全有效，基于Q-marker 的“五原则”预测血必净注射液的Q-marker：1）通过对血必净注射液原药材、注射液及其入血成分的系统辨识及对比归属，预测32 个入血成分作为血必净注射液中具有质量传递与溯源性的Q-marker。2）从含量测定和指纹图谱两个方面，预测13 个化学成分作为血必净注射液中具有可测性的的Q-marker。3）根据化学成分的含量高低及药理作用，分别预测14 个化学成分作为血必净注射液中具有特有性的Qmarker 和9 个化学成分作为血必净注射液中与药效关联的Q-marker。4）基于网络药理学阐释血必净注射液君臣佐使协同发挥COVID-19 药效的配伍特色，并预测10 个活性成分作为体现血必净注射液复方配伍环境的Q-marker。结果发现不同原则下预测血必净注射液Q-marker 有所差异，但中药复方Q-marker 应同时满足“五原则”。故选取与血必净注射液有效性密切相关、具有溯源性、可测性强、特有性好的羟基红花黄色素A、丹酚酸B、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 作为血必净注射液的Q-marker，后期通过建立同时测定血必净注射液中羟基红花黄色素A、丹酚酸B、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 含量的HPLC 方法，评价血必净注射液的质量优劣，为血必净注射液的临床研究和质量控制研究提供依据。