益智总黄酮超声辅助提取工艺的响应面法优化及其抗氧化活性评价

李生茂，李倩茹，张馨予，林雪晶，雷 蕾，周春阳

（川北医学院药学院，四川 南充 637100）

益智为姜科山姜属植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果实，为传统药食同源中药，是海南产道地药材，也是“四大南药”之一，具有暖肾固精缩尿，温脾止泻摄唾的功效[1]。除药用外，益智在食品、保健品等领域也应用广泛。早在晋代《南方草木状》中就有关于“……尝以益智粽饷魏武帝”的记载[2]。海南部分地区也有将益智鲜果腌渍后食用的习俗，具有治胀气及腹痛、助消化的作用。近年来，以益智为主料还制成果脯、酒、蜜饯、糖及茶等多种食品或保健品，具有较高的开发价值[3-4]。

现代研究发现，黄酮类成分是益智重要的活性物质之一，具有抗氧化、抗炎、神经保护和抑菌等多种药理活性[5-7]。目前，关于益智总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性的研究较少，且未见有总黄酮与抗氧化活性相关性的研究报道。为了更好地开发利用益智药材资源，本文以益智总黄酮提取率为指标，在单因素试验考察甲醇浓度、超声时间及液料比对益智总黄酮提取率影响的基础上，采用响应面（Box-Behnken）试验设计优化了其超声辅助提取工艺，采用DPPH、ABTS 和FRAP 法评价了其体外抗氧化活性，并探讨了益智总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），由美国Sigma 公司生产；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、过硫酸钾，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；芦丁，由四川省维克奇生物科技有限公司生产；维生素C，由广东光华科技股份有限公司生产；甲醇（分析纯），由成都市科龙化工试剂厂生产；水为超纯水，实验室自制；益智，经川北医学院药学院李毅主任中药师鉴定为姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果实，样品S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10 的产地为海南，样品S3 的产地为云南，样品S4 的产地为广东。

1.1.2 仪器与设备

Muitiskan Go 全波长酶标仪，Mettle AE 240 十万分之一电子天平，KQ-300DE 型超声清洗器，N4 紫外分光光度计，TGL-18 台式高速冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取芦丁适量，加甲醇配制成浓度为1 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。分别精密吸取芦丁对照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 至10 mL 具塞比色管中，再依次加入4 mL 1%AlCl3溶液，2 mL pH 为5.4 的醋酸-醋酸钠缓冲液，并加甲醇至10 mL，摇匀，40 ℃水浴静置20 min，于410 nm 处测定吸光度值[8]。以芦丁对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=25.102C-0.011 2（R2=0.999 2），芦丁在0.005～0.03 mg/mL 范围内线性关系良好。

1.2.2 益智总黄酮的提取

取各益智样品粗粉（过2 号筛），每份约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入一定体积的不同浓度甲醇，称定质量，设定超声功率100 W，超声提取，放冷至室温，再称定质量，并用相应溶剂补足减失的质量，摇匀，于7 000 r/min 离心10 min，取上清液，备用。

1.2.3 益智总黄酮提取率的测定

精密吸取益智样品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，按“1.2.1”中的方法测定，根据标准曲线计算样品溶液中总黄酮浓度，并按以下公式计算总黄酮提取率。

w（%）=（c×V×n）/m×100

式中：w 表示总黄酮提取率（%）；c 表示提取液中总黄酮浓度（mg/mL）；V 表示提取液体积（mL）；n 表示稀释倍数；m 表示益智样品取样量（mg）。

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 甲醇浓度对益智总黄酮提取率的影响

以液料比20∶1（mL/g），采用不同浓度的甲醇（60%、70%、80%、90%和100%）对益智S10 样品超声提取60 min（超声功率100 W），考察不同浓度甲醇对益智总黄酮提取率的影响。

1.2.4.2 超声时间对益智总黄酮提取率的影响

固定液料比20∶1（mL/g），采用100%浓度的甲醇对益智S10 样品分别超声提取10、20、30、40、50、60 min（超声功率100 W），考察不同超声时间对益智总黄酮提取率的影响。

1.2.4.3 液料比对益智总黄酮提取率的影响

分别以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），采用100%浓度的甲醇对益智S10 样品超声提取60 min（超声功率100 W），考察不同液料比对益智总黄酮提取率的影响。

1.2.5 响应面法优化试验设计

在单因素试验的基础上，以总黄酮提取率为考察指标（Y），甲醇浓度、超声时间、液料比为自变量（X），采用响应面设计方法进行三因素三水平的试验，对益智总黄酮的超声辅助提取工艺条件进行优化，试验因素水平见表1。

1.2.6 益智样品总黄酮含量的测定

精密称取益智样品（S1～S10）粗粉，约1 g，按“1.2.5”中确定的最佳提取工艺条件制备样品溶液，精密吸取0.5 mL 至10 mL 具塞比色管中，按“1.2.3”中的方法测定并计算总黄酮含量。

式中：c 为提取液中总黄酮浓度（mg/mL）；V 为提取液体积（mL）；m 为益智样品取样量（g）。

1.2.7 益智抗氧化活性的测定

1.2.7.1 DPPH 法测定抗氧化活性

分别取不同浓度供试样品溶液与230.50 μmol/L DPPH 甲醇溶液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混匀，40 ℃避光反应60 min，于517 nm 处测定吸光度值，设6 个复孔，按以下公式计算清除率[9]，并以清除率（Y）对样品浓度（X）进行对数回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时样品的浓度（IC50），另取阳性对照VC 溶液，同法测得其IC50值。

式中：A0为空白吸光度值（即以甲醇代替样品）；Ai为样品吸光度值。

1.2.7.2 ABTS 法测定抗氧化活性

将浓度为6.83mmol/L 的ABTS 溶液与2.46 mmol/L过硫化钾溶液等体积混合，室温暗处静置12 h，再加蒸馏水稀释，使其在734 nm 处的吸光值在0.70±0.02左右[10]。精密吸取不同浓度的供试品溶液与ABTS 液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混匀，40 ℃避光反应70 min，于734 nm 处测定吸光度，设6 个复孔，按以下公式计算清除率，并以清除率（Y）对样品浓度（X）进行对数回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时样品的浓度（IC50），另取阳性对VC 溶液，同法测得其IC50值。

式中：A0为空白吸光度值（即以甲醇代替样品）；Ai为样品吸光度值。

1.2.7.3 FRAP 法测定抗氧化能力

将300 mmol/L 的醋酸缓冲液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（用40 mmol/L HCl 配制）、20 mmol/L 的FeCl3溶液按体积比10∶1∶1 的比例混匀，37 ℃保温30 min，得FRAP 工作液[11]。精密吸取不同浓度的FeSO4·7H2O 溶液5 μL 与TPTZ 工作液150 μL 置于96 孔板中，迅速混匀，30 ℃反应5 min，于593 nm 处测定吸光度值。以FeSO4·7H2O 溶液浓度C（mmol/L）对吸光度值（Y）进行线性回归，绘制标准曲线为：Y=6.464 9C+0.038 4，R2=0.999 0，FeSO4·7H2O 线性范围为0.006 3～0.187 5 mmol/L。

取益智样品溶液5 μL 与TPTZ 工作液150 μL置于96 孔板中，迅速混匀，30 ℃反应5 min，于593 nm处测定吸光度值，样品的总抗氧化能力以Fe2+的还原当量（mmol/L）表示。另取阳性对照VC 溶液，同法测定其总抗氧化能力。

1.2.8 数据处理

采用Excel 2016 软件作图，Design-Expert 7.1.3.1软件进行响应面试验设计及分析，SPSS13.0 软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 甲醇浓度对益智总黄酮提取率的影响

如图1 所示，益智总黄酮提取率随甲醇浓度的增加而增加，当浓度达到90%时，其提取率增加趋势相对变缓，100%甲醇时提取率达到最高，这可能与益智中主要的黄酮类化合物多以黄酮类或黄酮醇类苷元（杨芽黄素、伊砂黄素、白杨素、山柰素、Kaempferol-7,4'-dimethyl ether、鼠李柠檬素和生松素）的形式存在有关[7]。

图1 甲醇浓度对益智总黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of methanol contents on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.2 超声时间对益智总黄酮提取率的影响

如图2 所示，在本试验条件范围内，超声时间对益智总黄酮提取率的影响较小，提取率总体随着超声时间的延长有缓慢增加趋势，在提取30 min 时提取率达到最高，此后随着超声时间的继续延长，总黄酮提取率趋于平稳。说明在黄酮含量一定的情况下，在提取一定时间后，提取液中总黄酮与药材细胞中总黄酮浓度已达到平衡，再延长超声时间则浪费时间和能源。

图2 超声时间对益智总黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of ultrasound time on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.3 液料比对益智总黄酮提取率的影响

如图3 所示，随着提取溶剂用量的增加，益智总黄酮提取率逐渐增加，当液料比增加到20∶1（mL/g）时，总黄酮的提取率达到最大值，而后随液料比的增加，提取率相对稳定，增幅较小。原因可能是液料比达到20∶1（mL/g）时，益智样品中总黄酮几乎完全被提取，故增加提取溶剂用量后总黄酮提取率增幅也不显著。

图3 液料比对益智总黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2 响应面法优化益智总黄酮超声辅助提取最佳工艺试验结果

2.2.1 模型的建立与分析

响应面试验设计方案及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface

通过Design-Expert 7.1.3.1 软件对表2 中的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到总黄酮提取率（Y）对甲醇浓度（A）、超声时间（B）、液料比（C）的回归模型方程为：Y=-1.828 95+0.036 152A+1.017 5×10-3B+0.030 63C-4.75×10-5AB-1×10-5AC-1.8×10-4BC-1.342 5×10-4A2+1.257 5×10-4B2-4.87×10-4C2。

响应曲面图可更加直观地反映甲醇浓度（A）、超声时间（B）、液料比（C）3 个因素两两交互作用对益智总黄酮提取率的影响（图4）。响应曲面的陡峭程度与该交互作用的显著性成正比，曲面越陡峭，说明交互作用越显著。等高线的椭圆率也可以直观地反映交互作用的强弱，等高线椭圆率越大，说明该交互作用越显著[13]。由图4 可知，AB、BC 及AC 之间交互作用对总黄酮提取率的影响均不显著。

图4 各因素间的交互作用对益智总黄酮提取率影响的响应面图Fig.4 Response surface diagrams showing the effects of interactive items on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2.2 最佳提取工艺条件的确定

通过响应面分析确定益智总黄酮最佳提取工艺条件为：甲醇浓度100%，超声时间20 min，液料比25∶1（mL/g），该条件下益智总黄酮提取率的理论值为0.766%。在最佳提取工艺条件下进行验证试验，益智总黄酮平均提取率为0.757%，该结果与理论值比较接近，相对标准偏差（RSD）为1.65%，表明响应面模型可靠性较高，具有一定的实际应用价值。

2.3 10 个批次益智总黄酮含量比较

如表4 所示，10 个批次益智的总黄酮含量有明显差异，含量在2.917～7.565 mg/g，最大值是最小值的2.5 倍左右，含量的高低顺序依次为：S10＞S5＞S9＞S7＞S2＞S3＞S8＞S6＞S1＞S4，但影响各批次益智总黄酮含量高低的具体原因还有待于进一步研究。

表4 10 个批次益智总黄酮含量Table 4 Total flavonoids contents of AOF 单位：mg/g

2.4 10 个批次益智抗氧化活性测定结果

2.4.1 清除DPPH 自由基能力

DPPH 自由基是一种人工合成的、比较稳定的含氮自由基，常被用来评价物质的体外抗氧化活性。其甲醇或乙醇溶液呈深紫色，在517 nm 处有强吸收。当向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物质时，其N 原子上的孤对电子被配对而褪色，褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因此可以根据溶液褪色的程度来评价样品的抗氧化能力。即样品与DPPH 自由基反应后混合溶液颜色越浅，在517 nm 的吸光度越小，样品清除DPPH 自由基的能力越强[14]。由表5 可知，10个批次益智样品对DPPH 自由基均有较好的清除能力，IC50值在0.851～3.188 mg/mL（相当于生药）之间，但均弱于VC。

2.4.2 清除ABTS 自由基能力

ABTS 二铵盐经过硫酸钾氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基，在734 nm 处有强吸收。当体系中有抗氧化物质存在时，ABTS 自由基与之反应，颜色变淡。因此可以根据溶液颜色变化的程度来评价样品的抗氧化能力[15]。即样品与ABTS 自由基反应后混合溶液颜色越淡，在734 nm 的吸光度值越小，样品清除ABTS 自由基的能力越强。由表5 可知，10 个批次益智样品对ABTS 自由基均有较好的清除能力，IC50值在0.642～1.789 mg/mL（相当于生药）之间，但均于弱于VC。

表5 10 个批次益智总黄酮清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和总抗氧化能力Table 5 Total flavonoids contents,DPPH free radical,ABTS free radical scavenging capacities and total antioxidant capacities of AOF

2.4.3 总抗氧化能力

在酸性条件下，Fe3+-TPTZ 可被样品中抗氧化物质还原为Fe2+-TPTZ，并呈现出明显的蓝色，在593 nm处有强吸收。当体系中的Fe3+-TPTZ 过量时，检测Fe2+-TPTZ 的生成量可评价样品的还原能力，即总抗氧化能力[16]。由表5 可知，10 个批次益智样品均有较好的总抗氧化能力，其FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L之间，但均弱于VC。

2.5 益智总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析

为进一步明确益智抗氧化活性与其总黄酮含量之间的关系，采用SPSS13.0 软件Pearson 相关分析法对益智中总黄酮的含量与抗氧化活性的相关性进行了分析。由表6 结果显示，益智总黄酮含量与清除DPPH 自由基的IC50值呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.679；总黄酮含量与总抗氧化能力FRAP 值呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.761；总黄酮含量与清除ABTS 自由基IC50值也呈负相关，相关系数为-0.431，但相关性不显著。分析原因，一方面可能是益智中除了富含黄酮类成分外，还存在原儿茶酸、多酚等类抗氧化成分[7,17]，其抗氧化作用的发挥是包括黄酮类成分在内的多类成分共同作用的结果，另一方面也可能是益智黄酮包含有大量黄酮类及黄酮醇类化合物，具有多样性[7]，其与不同自由基的反应能力及机制有所不同。故益智总黄酮的含量与清除DPPH自由基的IC50值和总抗氧化能力FRAP 值具有显著的相关性，而与清除ABTS 自由基的IC50值相关性不显著，但具体原因还有待于进一步研究。

表6 益智总黄酮含量与其抗氧化活性的Pearson 相关分析Table 6 Pearson correlation analysis of total flavonoids contents and antioxidant activities of AOF

3 结论

在单因素考察的基础上，采用响应面试验设计对益智总黄酮的超声辅助提取工艺进行了优化，确定益智总黄酮超声辅助提取的最佳工艺为：甲醇浓度100%，超声时间20 min，液料比25∶1（mL/g），在该条件下益智总黄酮的提取率为0.757%，与回归模型预测值（0.766%），较为接近，说明该模型可靠性较高，对于生产实践有一定指导意义。抗氧化活性结果表明，益智总黄酮具有较好的体外抗氧化活性，其清除DPPH 自由基、ABTS 自由基的IC50值分别在0.851～3.188 mg/mL（相当于生药）、0.642～1.789 mg/mL（相当于生药）之间，总抗氧化能力FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L 之间，总黄酮含量与清除DPPH 自由基的IC50值和总抗氧化能力FRAP 值呈显著相关（P＜0.05），但与清除ABTS 自由基的IC50值相关性不显著。研究结果为药食同源中药益智在食品、保健和医药等方面的进一步开发利用提供了一定的试验基础。