亲水色谱在食品内源组分分离分析方面的应用进展

邢倩倩，刘振民，游春苹

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

亲水色谱是一种类似于正相色谱保留模式的分离手段，主要以水（2%～40%）和乙腈（大于60%）作为流动相在极性固定相表面完成目标物质分离。亲水色谱固定相主要以硅胶或有机聚合物等为载体，通过衍生化上氨基、氰基、二醇基、酰胺基、聚(琥珀酰亚胺)基、糖基及两性离子基团构成[1]。乙腈是亲水色谱模式下最常用的有机流动相，甲醇和其他低质子数的醇可作为有机流动相与亲水性能较好的固定相结合使用[1]。亲水色谱流动相中常用的缓冲盐为甲酸铵、乙酸铵等挥发性盐，该类缓冲盐与质谱、蒸发光散射检测器和电喷雾检测器具有较好的适应性。

亲水色谱主要通过极性化合物在高比例有机溶剂的流动相和极性固定相表面的富水层之间的分配作用来实现分析物的保留。亲水色谱保留作用机理不仅仅是液液分配，还包括离子作用、氢键作用和偶极-偶极作用表现出来的吸附作用[2]。固定相、流动相、分析物以及它们的共同作用（例如固定相-流动相、固定相-分析物、流动相-分析物和固定相-流动相-分析物）等次级作用也会影响亲水色谱保留机理[3]。通常判断一个化合物是否适合亲水色谱分离的经验法则就是这个物质是否在反相色谱没有保留，同时这个化合物是否为极性亲水物质（比如logKow 和logD 为负值）。

本文围绕亲水色谱在食品内源组分（核苷碱基、核苷、核苷酸，氨基酸、多肽和蛋白质，磷脂酰胆碱类化合物，碳水化合物，维生素）分离分析方面的应用展开讨论，以期为食品中未知成分的分离分析提供参考。

1 亲水色谱在食品核苷碱基、核苷和核苷酸分离分析方面的应用

核酸碱基、核苷和核苷酸是一类亲水、强极性、不易挥发的有机分子，在中性流动相体系中易转化为阴离子，因此有学者在反相模式下使用离子对和离子交换色谱完成该类化合物的分离分析[4]。液相色谱和毛细管电泳色谱在核酸碱基、核苷和核苷酸的分离分析方面已有应用[5-8]。但是毛细管电泳色谱所用的流动相与离子检测手段（如质谱）无法兼容。亲水色谱能够克服已有技术的局限应用于植物来源和动物来源的核酸碱基、核苷和核苷酸的识别和定量分析。

1.1 果蔬及其相关制品

银杏的果和叶作为膳食补充剂应用广泛。Yao 等[8]和Zhou 等[9]采用亲水色谱串联MS/MS 检测手段在MRM 模式下分别完成银杏果和银杏叶中核酸碱基和核苷的定量。通过使用核酸碱基和核苷作为标志物可将22 种银杏叶样品按照其原产地分为两大类。

周翔等[10]建立亲水色谱串联三重四级杆质谱法同时测定酸枣仁中11 种核苷及碱基类成分的含量。色谱柱填料为键合酰胺基的亚乙基桥杂化硅胶颗粒。该方法适用于酸枣仁中核苷及碱基类成分的快速定量分析。

1.2 婴儿食品

亲水色谱在婴儿食品中核苷类物质的分离分析方面应用较广。有学者使用氧化铝和锡中空纤维膜对样品中目标化合物进行富集后，结合亲水色谱串联二极管紫外检测器完成人乳和婴儿配方乳中5-单核苷酸的定量。该方法在定量分析婴儿奶粉中的胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、肌苷和单磷酸鸟嘌呤核苷均具有良好表现[7,11]。有学者采用稀释、高速离心和样品洗脱后使用亲水离子对和亲水色谱串联MS/MS 完成16 种含乳婴儿食品和非含乳婴儿食品中的20 种核苷和核苷酸进行分离检测。该方法在9 min 的梯度洗脱时间内完成核苷、单磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸的分离检测[12]。定量限优于其他毛细管电泳和电喷雾质谱以及纳米液相色谱紫外方法[5,7]。

1.3 其他食品基质

有学者建立同时测定16 种核苷碱基和核苷的分析方法用来完成8 个批次不同产地和种属的灵芝样品的质量评价。柱温25 ℃下，流动相为包含15 mmol/L乙酸铵的乙腈水（V∶V=5∶95）梯度洗脱可得到最好的分离效果，且可串联质谱和紫外检测（254 nm），该方法可成功区分不同产地和种属的灵芝[13]。

综上所述：核苷碱基、核苷和核苷酸作为食品内源物质，其含量较高，均为小分子强极性化合物，且大部分结构包含共轭双键，对检测器无特殊要求，常规紫外检测器即可满足检测要求；使用亲水色谱串联紫外检测方法可应用于不同食品基质中核苷碱基、核苷和核苷酸的定量定性分析。

2 亲水色谱在食品氨基酸、多肽和蛋白质分离分析方面的应用

蛋白质、磷蛋白质和糖蛋白质可直接用亲水色谱或经典排阻液相色谱完成分离[14]。在开发该类方法过程中，亲水色谱的流动相为高比例有机相，但是这种溶剂环境下蛋白质易发生沉淀，导致溶解性不匹配。有关氨基酸含量测定的分析方法，包括不需衍生化的直接分析方法和涉及分离纯化和衍生化的非直接分析方法[15-16]。亲水色谱串联质谱检测器最常见用于定性定量分析食品中自由氨基酸和活性肽。

2.1 动物来源食品

肉类、海鲜、牛奶和乳制品是膳食中蛋白质的主要来源。动物来源的蛋白质比植物蛋白质结构更复杂。动物蛋白包含大量未知化合物，如小分子蛋白和生物活性肽，其含量可从百分比数量级到百万分比数量级。

2.1.1 鸡汤

Macia 等[17]选择非功能性亚乙基桥杂化颗料填充柱作为亲水柱对鸡汤中的肌肽和鹅肌肽进行分析研究，并与两款相同规格的C18柱分离效果对比。该色谱方法在亲水色谱柱10 min 内完成，分离效果优于反相色谱和离子交换反相色谱。

2.1.2 肉制品

Broncano 等[18]采用亲水色谱串联MS/MS 用于分析西班牙腊肠提取物中具有抗氧化活性的亲水小分子化合物（自由氨基酸、二肽、三肽以及肉毒碱、肌肽、鹅肝肽、牛磺酸和一些小分子微量化合物如肌酸或缬氨酸）。分析条件为在两性离子固定相用6.7 mmol/L乙酸缓冲盐和乙腈的流动相梯度洗脱。

2.1.3 海鲜

Tsochatzis 等[19]对冷冻干燥后的紫贻贝中21种氨基酸展开研究，前处理后得到的样品使用键合氨基的亚乙基桥杂化硅胶颗粒色谱柱进行分离分析串联二级质谱检测。该方法具有理想的线性相关关系、精密度、回收率和灵敏度，回收率和准确度也符合定量要求。

二肽精氨酰（咸味增强剂）可以使用亲水色谱方法在氨基柱上完成分析过程。该方法成功应用于实验室合成样品、商业水解样品以及发酵鱼子酱样品中二肽精氨酰的定量分析[20]。

2.1.4 牛奶

赵瑞等[21]建立牛乳中未衍生游离氨基酸的超高效液相色谱串联质谱的测定方法。前处理后得到的样品使用硅胶亲水柱进行分离分析。流动相为含10 mmol/L 甲酸铵的水和含2 mmol/L 甲酸铵和3%水的乙腈（均含有0.15%甲酸）。该方法可在14 min 内将所分析目标物较好分离。

2.2 蔬菜、水果、种子及其相关产品

桃核中含具有抗氧化活性的多肽类化合物，提取多肽过程包括磨粉、脱脂、提取，然后通过加入冷丙酮并放入冰箱，蛋白质可从上清液中析出，接下来将蛋白质进行酶水解，然后使用超滤滤出多肽提取物。肽段信息可经过亲水色谱柱（未键合硅胶柱）分离或反相色谱（键合C18固定相硅胶柱）分离后通过电喷雾-飞行时间质谱获得，检测到18 种含高比例亲水氨基酸的肽[22]。

2.3 液体食物和饮料

Gokmen 等[23]采用亲水色谱串联轨道离子肼质谱用6 min 时间对液体食品（啤酒、果汁、葡萄酒、茶和蜂蜜）中的22 种氨基酸进行分离分析。将样品用乙腈水（V∶V=1∶1）稀释过滤后直接进样即可。流动相为水和添加0.1%甲酸的乙腈，色谱柱为非键合硅胶填料柱。

综上所述，氨基酸、多肽和蛋白质均为强极性物质，其分子量分布较广，该类物质主要使用亲水色谱串联质谱完成检测。

3 亲水色谱在食品磷脂酰胆碱类化合物分离分析方面的应用

近些年，胆碱类和磷脂类化合物在食品中的重要性越来越明显，相关的分离分析方法研究也越来越多。核磁共振磷谱在定性定量分析食品中含磷化合物的含量方面表现优异，也能够对磷脂的同源物进行分析[24-25]。液相色谱串联荧光检测器、质谱检测器和蒸发光散射检测器以及气相色谱串联质谱检测器在胆碱类化合物和磷脂分离分析方面均有应用，但是尚未有同时定量所有胆碱类化合物和所有磷脂的分析方法[26]。有学者用正相色谱串联质谱分析胆碱类化合物和磷脂，尽管磷脂和胆碱类化合物具有较好的保留和分离度，但是由于流动相为非极性溶剂，不适合用电喷雾质谱作为检测器[27]。反相色谱串联质谱可分离特定的不同酰基链长度和不同不饱和度的磷脂酰胆碱类物质。

3.1 动物来源食品

3.1.1 蛋黄

Zhao 等[28]使用非键合硅胶柱在流动相为乙腈和甲酸铵的水体系下对蛋黄中的胆碱类物质完成分离定量。该方法还可用质谱根据分子量和碎片信息区分同一类化合物的不同种。该课题组还建立了一种均相萃取法，用于提取食品和生物样品中8 种磷脂同系物和6 种水溶性胆碱类化合物，该萃取法得到的样品可直接进入质谱检测器[29]。

3.1.2 海鲜

Shen 等[30]自制TiO2键合硅胶填充SPE 柱，经过SPE 处理后提取，选择亲水色谱串联高分辨质谱研究虾酱中的磷脂组成。在流动相分别为乙腈和pH 值为4.0～4.5 的甲酸水溶液、60 mmol/L 甲酸铵水溶液和pH 值为3.6 的53 mmol/L 甲酸水溶液组成下，使用二醇基色谱柱分析检测到69 种磷脂类物质。该色谱柱可用于分析检测经SPE 处理后5 种海马提取物中的50 种磷脂同系物，所用的分析条件为50 ℃柱温，梯度洗脱，流动相为10 mmol/L 甲酸铵和0.2%甲酸的水溶液及0.2%甲酸的乙腈溶液[31]。

3.1.3 牛奶

Russo 等[32]采用流动相pH 为5.5 对磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂在非键合硅胶色谱柱上进行分离，检测器为蒸发光散射检测器。该分离方法还可串联离子肼-飞行时间质谱检测器用于不同化合物的定性。

Liu 等[33]通过亲水色谱串联质谱对32 种牛奶样品进行分析，定性出70 种不同的极性脂，其中22 个物质为首次报道。

3.2 果蔬、豆类及其相关制品

何秀梅等[34]建立亲水色谱串联质谱法测定圆椒中磷脂含量，分别以磷脂酰胆碱、溶血磷脂乙醇胺、溶血磷脂胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油酸、溶血磷脂丝氨酸为对照进行相对定量。

Lewis 等[35]研究北美豆类中的游离胆碱和胆碱类物质（甘油磷酰胆碱、磷酸胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱）含量，对比烹调前后营养磷脂含量的变化。所用分析方法为非键合实心硅胶色谱柱分离串联质谱检测，二元流动相为乙腈和pH 为3.0 的10 mmol/L 甲酸铵水溶液，分析时间为30 min，该方法可合理地分离检测目标化合物。Verardo 等[27]对在4 ℃下保存12 h 的初级鲜榨橄榄油中的磷脂和磷脂丢失进行定量分析。该分析方法在非键合实心硅胶色谱柱上完成，使用电喷雾飞行时间质谱检测器进行检测。所建立方法可通过定量分析磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰用于橄榄油的磷脂谱表征。

综上所述，磷脂胆酰类化合物为强极性物质，分子量范围广泛，由于该类物质包含磷酸基团，因此磷脂胆酰类化合物的分离分析方向一直是难点，亲水色谱串联质谱手段可有效解决该难点。

4 亲水色谱在食品碳水化合物分离分析方面的应用

亲水色谱串联不同检测技术作为最适宜于糖类化合物分离分析的手段，其通过性可与光谱法结合化学计量分析法的直接分析方法比拟[36]。其他分析手段如核磁、电化学分析和气相色谱法等，存在灵敏度不足、重现性差和需要衍生等劣势。

4.1 动物来源食品

Liu 等[37]采用亲水色谱串联轨道离子肼质谱方法，通过使用二醇基色谱柱同时分离牛乳中13 种寡糖。该方法使用水苏糖和毛蕊花糖作为中性低聚糖类似物，3 种酸性低聚糖包括3-唾液乳糖（3-sialyllactose）、6-唾液乳糖（6-sialyllactose）和6-唾液氨基乳糖（6-sialyl-lactosamine）作为参考标准物质。该方法成功应用于由3 种不同饮食饲养的牛所产的32 份牛乳样品，所得数据证明不同牛乳中寡糖谱的变化与其中主要的寡糖密切相关。

Martín-Ortiz 等[38]选择亲水色谱串联质谱在氨基修饰固定相上分离和定量主要的寡糖，并在山羊初乳中发现新天然活性寡糖。该研究考察了梯度条件、柱温和流动相中不同种类改性剂对分离结果的影响，确定最佳分离条件为：流动相为乙腈和0.1%氨水溶液，柱温40 ℃。该研究首次通过质谱分离鉴定出山羊初乳中的78 种寡糖化合物，对比山羊乳、牛乳和人乳中的寡糖谱，并揭示山羊初乳可作为天然寡糖的有效来源。

4.2 果蔬、农作物及其相关制品

Ghfar 等[39]选择超高效液相色谱串联质谱法用于同时测定枣提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量。经过条件优化，在氨基柱上梯度洗脱，7 min 内完成分离分析。流动相为乙腈和0.1%氨水的水溶液，流速为0.4 mL/min。

Ouerdane 等[40]选择氨基固定相色谱柱对硒糖进行分离分析，并用电喷雾轨道离子肼质谱进行表征，首次对富硒土地种出的农作物提取物如小麦、大米和玉米中的硒糖进行定量分析，该方法还可用于分析黑介种子和芸苔属蔬菜中的硒糖。

4.3 其他食品基质

有学者选择亲水色谱串联质谱分析液体样品如葡萄酒、啤酒、牛奶、果汁和植物提取物中的单糖、二糖和寡糖混合物[37,41]。选择离子交换和离子排阻色谱去除酚醛类化合物和多糖后，制备得到寡糖类组分。每个组分首先在氨基磺酸基键合硅胶色谱柱分析，均用电喷雾质谱和离子肼质量分析器处理[42]。

Kotoni 等[41]使用亲水色谱新型固定相从啤酒中分离出单糖、二糖和麦芽糖等低聚物。该固定相选择2.5 μm 全多孔硅胶经过一锅法和封端技术处理，表面键合桥连双尿基和自由氨基酸。与传统色谱柱如乙基桥键合氨基杂化硅胶和纯实心硅胶相比，该固定相具有更好的分离性能和峰型。

夏碧琪等[43]建立亲水相互作用色谱-串联质谱法测定葡萄酒中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍药素、飞燕草素葡萄糖苷和氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷4 种花青素的分析方法。该方法选择的色谱柱为两性离子修饰硅胶色谱柱，流动相为乙腈和20 mmol/L 乙酸铵溶液，目标化合物在梯度洗脱条件下采用多反应监测模式进行检测。

综上所述，糖类化合物为强极性物质，分子量范围广泛，亲水色谱在糖类化合物分离分析方面应用较广泛。

5 亲水色谱在食品维生素分离分析方面的应用

亲水色谱在水溶性维生素的分离分析上具有较大优势。陈翔等[44]建立亲水色谱串联三重四级杆质谱法，对白茶鲜叶中氨基酸、核苷酸、维生素和辅酶、糖类和甘油磷脂类等小分子代谢物进行靶向代谢谱分析，旨在了解白茶萎凋过程中代谢物的变化规律及其对白茶品质的影响，并为白茶萎凋工艺技术参数的确定提供分子水平的理论依据。该方法使用亚乙基桥键合氨基硅胶柱，流动相为添加25 mmol/L 乙酸铵和25 mmol/L 氨水（pH=9.75）水溶液和乙腈，整个分析过程耗时23 min。吴昊等[45]建立亲水色谱串联紫外检测器分析饮料中VC 含量。该方法采用氨丙基键合硅胶色谱柱，流动相为0.02 mol/L 磷酸二氢钾水溶液和甲醇，检测波长为249 nm。使用该方法进行分析时VC化合物的保留时间在9 min 左右，能够克服VC 在反相色谱柱上保留不足的问题，有效分离饮料样品中的杂质，获得尖锐、对称性好的目标峰。

综上所述，维生素为小分子强极性物质，亲水色谱可与反相色谱结合应用于维生素的分离分析。

6 展望

亲水色谱在分离强极性和离子型化合物方面的优势使其在食品内源组分方面可与反相色谱互补应用。亲水色谱在食品内源组分的分离分析方面应用越来越广，已被广泛认为是一种可用于食品质量控制分析的方法。未来，亲水色谱可与食品组学结合用于详细阐述食品的物质基础，同时也可应用于人体代谢产物和肠道微生物代谢产物的分离分析。