高效降解1，2-丙二醇菌株的筛选及其性能研究

司景， 边侠玲

（1.安徽环境科技研究院股份有限公司， 合肥 230088； 2.安徽安生生物化工科技有限责任公司， 合肥 230088）

1，2－丙二醇为无色无味、 黏稠性较大的液体，与水、 乙醇及多种有机溶剂混溶， 是重要的化工原料或助剂［1］。 由于其吸湿性和特殊的溶解性， 被广泛应用于印染和抗冻剂等领域［2］。 不论是1，2－丙二醇的生产过程还是将其作为原料使用， 都会产生大量含1，2－丙二醇的废水［3］， 当其排放浓度较高时， 对环境有害且会对动物的中枢神经系统产生抑制［4］。

生物法处理废水具有成本低、 效率高、 操作简单、 无二次污染等优点。 生物法处理含高浓度1，2－丙二醇废水的关键在于微生物菌种的筛选， 筛选具有高效降解性能的微生物已成为废水生物法处理的核心工作［5－7］。 本研究从化工厂废水处理站活性污泥中筛选得到6 株耐受1，2－丙二醇的菌株， 经进一步筛选与驯化， 从中得到1 株能高效降解1，2－丙二醇、 除醇能力较好的菌株， 对该菌株进行了鉴定， 并考察了不同因素对该菌株降解1，2－丙二醇的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

（1） 菌种来源。 菌种取自安徽省铜陵市某化工厂废水处理站的活性污泥。

（2） 模拟废水。 按照新鲜污泥与水体积比为9 ∶20 共配制1 000 mL， 向其中加入5 mL 营养液（淀粉、 尿素、 磷酸钙的质量比为20 ∶2 ∶1）， 混合均匀， 加入1，2－丙二醇（体积分数为0.5%）， pH 值控制在7.0±0.2。 经测定， 模拟废水COD 初始质量浓度为12 801 mg／L。

（3） 富集培养基。 酵母粉10 g／L， 蛋白胨20 g／L， 葡萄糖20 g／L， 琼脂20 g／L（配制固体培养基时加入）， 其余为蒸馏水。 121 ℃灭菌20 min。

（4） 筛选培养基。 在富集培养基加入1，2－丙二醇溶液（体积分数为0.5%）。

1.2 试验装置

试验装置为活性污泥生化反应器， 该反应器内径为12 cm， 高度为120 cm， 通过循环水浴控制反应器温度。 反应器设置有污泥循环管道， 便于优势菌群的富集； 反应器上配有温度计和pH 计， 实现实时监测。

1.3 试验方法

（1） 菌种分离与纯化。 将取自化工厂废水处理站的活性污泥样品置于锥形瓶中， 摇匀后取1 mL稀释至106倍。 吸取稀释后的样品100 μL 涂布在富集培养基中， 30 ℃培养3 d， 挑取单菌落至新的富集培养基中划线分离得纯种菌。

（2） 筛选与驯化。 将上述分离所得纯种菌接种至筛选培养基进行培养， 挑选出长势较好的菌株，并进行保存。

（3） 菌株的鉴定。 采用16S rDNA 方法对筛选出的菌株进行鉴定。

（4） 生长曲线的测定。 将已活化的菌液按2.0%（体积分数）的接种量接至富集培养基中， 于30 ℃、 200 r／min 条件下培养， 在不同时间点取样，测定菌液的OD600值。 以时间为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制出生长曲线。

（5） 最佳除醇pH 值的确定。 向反应体系中加入适量NaOH 和HCl 溶液， 调节模拟废水pH 值分别为3、 5、 7、 9、 11， 并加入5.0%（体积分数）菌液， 于30 ℃条件下培养6 d 后， 取样分别测定COD浓度和OD600值， 根据COD 降解率确定最佳pH 值。

（6） 最佳除醇温度的确定。 调节反应体系pH值至最佳pH 值， 向其中加入5.0%（体积分数）菌液， 在温度分别为25、 30、 35、 40、 45 ℃， 培养6 d 后， 取样分别测定COD 浓度和OD600值， 根据COD 降解率确定最佳温度。

（7） 最佳除醇时间的确定。 在上述所得最佳pH 值和温度条件下， 向反应体系中加入5.0%（体积分数）活化后的菌液， 每24 h 取样。 取样后测定COD 浓度并进行气相色谱（GC）分析。

1.4 分析方法

COD 浓度采用重铬酸钾法［8］。

1，2－丙二醇的检测方法为气相色谱法。 采用Inert Cap 系列气相色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 进样口温度： 250 ℃； 程序升温： 80 ℃（1 min）→200 ℃（3 min）→250 ℃（3 min）。 载气： 高纯空气， 流量： 0.5 mL／min； 进样方式： 分流进样， 分流比30 ∶1； 进样量： 1.0 μL。

模拟废水中有机污染物只有1，2－丙二醇， 因此采用COD 降解率（η）来说明1，2－丙二醇被微生物降解的情况， 公式如下：

式中： C0、 Ct分别为初始、 处理后的COD 质量浓度， mg／L。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

从活性污泥样品中共筛得6 株生长情况较好的微生物， 分别记为GLY－1， GLY－2， GLY－3， GLY－4， GLY－5， GLY－6。 将这6 株微生物分别接入筛选培养基中， 于30 ℃、 200 r／min 的条件培养3 d 后，取样测定COD 浓度和OD600值， 结果见表1。

从表1 可以看出， 6 株菌在筛选培养基中都可以降解1，2－丙二醇， 其中以GLY－4 菌株的降解效果 最 好， COD 降 解 率 可 达99.32%。 因 此 选 择GLY－4 菌株为后续试验菌。

表1 6 株微生物的COD 降解率和OD600 值Tab. 1 COD degradation rate and OD600 value of 6 strains

2.2 菌株鉴定

将GLY－4 菌株的16S rDNA 序列与NCBI 中的序列进行比较， 该菌株与Pseudomonas nitroreducens同源性达到99%。 初步鉴定GLY－4 为硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）。

2.3 GLY－4 菌株生长曲线的测定

GLY－4 菌株的生长曲线如图1 所示。 由图1可以看出， GLY－4 在3 h 左右进入对数生长期， 在34 ～72 h 处于平稳期， 72 h 后进入衰亡期。

图1 CLY-4 菌株的生长曲线Fig. 1 Growth curve of CLY-4 strain

2.4 pH 值对GLY－4 除醇效果的影响

pH 值对GLY－4 除醇效果的影响如图2 所示。由图2 可以看出， 当pH 值过高（pH=11）或者过低（pH=3）时， COD 降解率均低于70%， 这是因为pH值过高或者过低， 对GLY－4 的生长不利， 菌株无法良好生长， 从而对1，2－丙二醇的降解效果变差，COD 降解率不高。 因此确定GLY－4 的最佳除醇pH值为7。

图2 pH 值对GLY-4 除醇效果的影响Fig. 2 Influence of pH value on 1,2-propylene glycol removal by GLY-4

2.5 温度对GLY－4 除醇效果的影响

不同温度对GLY－4 除醇效果的影响如图3 所示。 由图3 可以看出， 当温度为30 ℃时， GLY－4对1，2－丙二醇的降解效果最好， COD 降解率可达99% 以上。 结合OD600值可知， 在其他温度时GLY－4 的生长没有30 ℃时好， GLY－4 对1，2－丙二醇的降解效果变差， COD 降解率也相应降低。因此确定GLY－4 最佳除醇温度为30 ℃。

图3 温度对GLY-4 除醇效果的影响Fig. 3 Influence of temperature on 1,2-propylene glycol removal by GLY-4

2.6 反应时间对GLY－4 除醇效果的影响

COD 降解率随时间的变化情况如图4 所示。由图4 可以看出， 反应1 d 后COD 的质量浓度为10 632 mg／L， 6 d 后COD 的质量浓度降至81 mg／L， 低于100 mg／L。 其中1～2 d 内COD 浓度快速降低， 结合图1 的生长曲线可知， 此时微生物处于对数生长期和平稳期， 微生物快速增长并维持在较高浓度， 降解1，2－丙二醇的速率较快， 3 d 后微生物进入衰亡期， 菌体大量自溶、 菌浓较低， 降解1，2－丙二醇的速率变慢。

图4 COD 降解率随时间的变化情况Fig. 4 COD degradation rate changes along with time

1，2－丙二醇标准品（0.5%）的GC 图谱如图5（a）所示， 模拟废水经GLY－4 处理不同时间后所得样品的GC 图谱如图5（b）所示。

图5 1，2－丙二醇标准品与处理后样品的GC 图谱Fig. 5 GC spectrums of 1，2-propylene standard sample and treated sample

由图5 可以看出， 所得样品中均含有1，2－丙二醇， 并无其他杂峰； 与标准品峰面积相比， 随着处理时间的延长， 1，2－丙二醇特征峰的峰面积显著降低， 由此可知模拟废水中1，2－丙二醇含量越来越低； 6 d 后1，2－丙二醇无检出， GLY－4 对1，2－丙二醇的降解效果随时间的延长而越来越好。

3 结论

（1） 以某化工厂废水处理站的活性污泥为菌源， 筛选出6 株耐受1，2－丙二醇的微生物， 其中GLY－4 菌株微生物可对1，2－丙二醇具有较高的降解率， 经鉴定为硝基还原假单胞菌。

（2） 在pH 值为7、 温度为30 ℃的条件下，利用GLY－4 菌株处理1，2－丙二醇（体积分数为0.5%）模拟废水， 反应6 d 后COD 的降解率达到99.37%， 该菌株对1，2-丙二醇的降解效果随时间的延长而越来越好。