鸭坦布苏病毒病RT-PCR检测方法的建立
2021-09-07元正菊王巧萍张信艳严红亚李珂赵蓉常志顺王传禹信爱国
元正菊,王巧萍、2,张信艳、3,严红亚,李珂,赵蓉,常志顺,王传禹,信爱国*
(1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所,云南 昆明 650224;2.云南农业大学动物医学院,云南 昆明 650201; 3.水富市畜牧兽医技术推广站,云南 水富 657800)
鸭坦布苏病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus, DTMUV)感染蛋鸭和种鸭的一种新发传染病。该病可感染不同品种的鸭,患病鸭采食量、产蛋量急剧下降,剖检可见出血性卵巢炎。该病自2010年在中国发生以来,传播迅速,是危害养鸭业较严重的传染病之一[1]。2019年在云南省宜良县某种鸭场发现疑似病例,患病鸭表现站立不稳、瘫痪等神经症状;剖检可见卵巢充血、出血,卵泡变性、破裂,脾脏肿大,后经云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所确诊为鸭坦布苏病毒感染所致[2]。目前,该病在云南省主要水禽养殖区域传播的风险极高,建立快速、准确的病原检测技术,实施DTMUV病原监测,对防控该病具有重要意义。
DTMUV基因组为单股正链RNA病毒,大小约为10 990 nt,包含一个开放读码框(ORF),编码3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白PrM/M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[3]。目前,常规 RT-PCR 方法检测DTMUV的报道中,主要参照黄病毒科黄病毒属的NS5基因[4]或E蛋白基因[5]片段序列设计引物,或者针对DTMUV的E蛋白基因[6-8]片段设计引物建立检测方法。病毒E蛋白是病毒的重要毒力蛋白,也是重要的免疫原性蛋白,能诱导产生中和抗体[9],NS5 为黄病毒中最保守的非结构蛋白,具有RNA依赖的 RNA 聚合酶活性。
在云南水禽主要养殖区,临床诊断结合病例剖检发现 DTMUV 疑似病例,但临床上需与其他疫病鉴别诊断。为了解云南地区 DTMUV 感染流行情况,参阅已有的DTMUV快速检测方法以及分子流行病学研究文献,针对DTMUV建立RT-PCR检测方法,并应用于云南鸭临床样品的诊断检测研究。
1 材料与方法
1.1 病毒株
鸭坦布苏病毒YN2019株BHK-21细胞适应毒由本研究所分离保存。新城疫病毒( Newcastle disease virus,NDV) 、减蛋综合征病毒( Chicken egg down syndrome virus,EDSV) 、I型和III型鸭肝炎病毒 ( Duck hepatitis virus,DHV) 、传染性法氏囊病毒( Infectious bursal disease virus,IBDV) 、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)均由本研究所提供,H5/H7/H9亚型禽流感病毒( Avian influenza virus,AIV)灭活抗原购买于华南农大生物药品有限公司。
1.2 引物
根据已发表的DTMUV NS5蛋白基因序列,采用Vector NTI 8.0序列分析软件做对比分析,利用 Primer 5.0 软件自主设计了1 对针对NS5基因的检测引物;同时,参考文献[10]合成1对针对DTMUV E蛋白的检测引物作为平行检测引物,建立同时针对E基因和NS5基因的检测体系。引物序列见表1。引物由硕擎生物科技有限公司合成。稀释成工作浓度( 10 pmol/L)-20 ℃保存备用。
表1 DTMUV引物信息表
1.3 病毒核酸提取
采用宝生物工程(大连)有限公司生产的病毒RNAiso Plus试剂提取DTMUV及其他病毒RNA;按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书分别提取EDSV和FAdV的DNA,-80℃保存备用。
1.4 RT-PCR方法的建立
采用宝生物工程(大连)有限公司生产的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 建立一步RT-PCR方法检测DTMUV。RT-PCR反应总体系50μL,包括PrimeScript OneStep Enzyme Mix 2.0 μL,2× OneStep Buffer(Dye plus) 25.0μL,上下游引物各1.0μL,Total RNA 2.0μL,RNase-free ddH2O 19.0μL。反应程序为:50℃逆转录30min,94℃预变性2min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,共进行 35个循环;最后72℃延伸15min,4℃冷却。PCR结束后取5μL扩增产物进行1.5% 琼脂糖凝胶100V电泳30min,然后用凝胶成像系统观察结果。
1.5 特异性实验
用确定的最佳条件分别对阳性对照及其他相关的几种病毒进行RT-PCR检测,评价扩增DTMUV的特异性。同时胶回收阳性样品718bp的扩增产物条带送测序,结果提交NCBI网站,用Blast n 程序在线比对分析,验证其特异性。
1.6 敏感性实验
将提取的DTMUV-YN2019株细胞毒RNA测定浓度后,10倍梯度连续稀释,按上述RT-PCR方法进行扩增,测定模板最低检出量,判定该方法的敏感性。
1.7 重复性实验
用建立的RT-PCR检测方法对YN2019株细胞毒和1份DTMUV阳性样品重复检测3次,以验证本方法的重复性和稳定性。
1.8 临床样品的检测
将云南不同地区养鸭场收集的20份产蛋下降临床疑似样品,每份取约5.0g剪碎后加入4倍体积的PBS(pH7.2)研磨,反复冻融3次后,离心取上清提取总RNA,进行DTMUV的RT-PCR方法检测,并对部分样品的扩增产物进行测序验证。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增条件及产物
以DTMUV-YN2019株细胞毒提取的病毒RNA为模板,进行一步法 RT-PCR扩增,经优化的退火温度为56℃,引物浓度为10pmol/μL,扩增35个循环。针对NS5设计的引物能成功扩增出718bp大小的预期目的片段,与针对E基因扩增出483bp片段检测结果一致(图1)。
A. NS5基因片段扩增结果。M.DL2000 Marker; 1.阴性对照;2-4. DTMUV细胞毒扩增结果; 5.空白对照。B.E基因片段扩增结果。M.DL2000 Marker; 1-3.DTMUV细胞毒扩增结果。
2.2 特异性实验分析
本研究建立的RT-PCR 对DTMUV可扩增出718bp的目的条带,而对NDV、AIV(H5、H7、H9抗原)、EDSV、DHV、IBDV、FAdV则无扩增条带,阳性样品718bp的扩增产物条带经胶回收、测序,结果用NCBI网站的Blast n 程序在线比对分析,表明该核酸序列源于DTMUV基因组,说明该方法具有极高的特异性。
2.3 重复性实验分析
经过3次重复检测,试验结果完全一致,说明本研究建立的方法稳定性较好。
2.4 敏感性实验分析
将提取的YN2019细胞毒 RNA(浓度为32.4ng/μL) 连续10倍稀释后进行RT-PCR检测,结果见图2。检出的最低稀释度为1×10-3,则其敏感度为3.24pg/μL。
M.DL2000 Marker ; 1.1×100;
2.5 临床样品检测结果
将云南不同地区养鸭场收集的20份产蛋下降临床疑似样品提取RNA后进行RT-PCR方法检测,结果测定为阳性的有10份,其阳性率为50%,10个扩增产物的测序结果与NS5基因序列(登录号为KJ958533)的同源性为100%。
3 讨论
DTMUV是最近10年在我国开始传播的一种新发传染病,主要危害鸭和鹅,给养殖户带来极大损失,所以该病的检测和预防极其重要。该病多发生于产蛋鸭群,表现为鸭群突然出现采食下降,随后产蛋量急剧下降,剖检病鸭可见明显的卵泡出血和变性。在临床实践中,首先排除由于环境、饲料、药物以及饲养管理因素和其他可引起鸭产蛋量急剧下降的传染性疾病,如禽流感和新城疫,出现疑似鸭坦布苏病毒感染症状的时候,快速诊断是及早发现并阻断该病毒暴发的重要手段。
本研究针对DTMUV建立的一步法RT-PCR检测技术能特异性地扩增出718bp的序列,对BHK-21细胞毒和田间样品均能检出DTMUV,且仅能检出DTMUV,对其他鸭病(I型和III型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、H5/H7/H9亚型禽流感病毒抗原、减蛋综合征病毒、禽腺病毒)则无法检出,说明本方法特异性良好;同一样品多次检测的结果都是一致的,表明重复性和稳定性良好;能检出最低病毒含量为3.24pg/μL,表明该方法敏感性良好;在4 h之内可完成全部检测过程;应用本研究建立的RT-PCR方法对20 份临床可疑样本进行检测,检出的阳性为10 份,其阳性率为50%,表明该方法可应用于临床检测。2019年,DTMUV仅在云南省部分地区零星散在发生,但是本实验中检出阳性率为50%,表明该病在云南省有扩大传播范围的趋势。本研究建立的一步法RT-PCR方法具有灵敏、快速、稳定、特异性强的优点,对DTMUV的临床诊断和防控具有参考价值,可为后续的流行病学调查提供技术手段。云南地区的水禽养殖户应对该病引起重视,及时采取防控措施,避免因感染鸭坦布苏病毒而造成经济损失。