毛子草药材质量标准研究

胡寿荣，毕红玉，高燕平，游媛，任琦，付辉政

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.南昌市第一医院，江西 南昌 330008；3.江西中医药大学，江西 南昌 330004

毛子草为紫葳科角蒿属（Incarvillea L.）两头毛Incarvillea arguta（Royle）Royle的干燥全草，主要分布于我国西南地区，在东北、华北、西北等地也有分布。为苗族、彝族、傈僳族、纳西族、藏族、普米族等民族习用草药。具有祛风除湿、消炎止痛、活血散瘀之功效，临床上广泛用于治疗肝炎、结石等病，疗效显著［1-3］。贵州苗族地区用于防治胆石症有较好疗效，故又称其为“结石草”；彝族民间称为“瓦布友”，又名“肝炎草”“两头毛”“马桶花”“毛子草”等。其化学成分主要有单萜生物碱、大环精胺、环烯醚萜苷、生物碱、酰胺、黄酮、苯丙素类等成分，在促进细胞分化、消炎、抗菌、抗氧化、治疗胆结石等方面具有较好疗效［4-8］。毛子草现收载于《贵州中药材、民族药材质量标准》（2003年版）［9］，标准中规定有性状，鉴别（叶表面观、茎横切面、理化、对照药材薄层鉴别），检查（水分、总灰分、酸不溶性灰分）。在检验中发现其薄层主斑点存在拖尾现象，水分、总灰分、酸不溶性灰分限度设置不合理，尚缺含量测定项。基于此，收集了不同采收时间的19批次样品，对毛子草薄层鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量测定等质控指标开展了系统的研究，为毛子草药材质量标准修订和提高提供参考和依据。

1 仪器与试药

戴安UL TIMA TE3000 系列高效液相色谱仪：由色谱工作站、柱温箱、四元泵、自动进样器、紫外可变波长检测器5 个部分组成；电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）。电子天平使用的是赛多利斯BS110S 十万分之一电子天平；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水；其他试剂均为分析纯。

齐墩果酸对照品（批号：110709-201808）购自中国食品药品检定研究院；车前醚苷（批号：5928，纯度≥98%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

毛子草药材19批为本课题组收集，由江西中医药大学钟国跃教授鉴定为毛子草［Incarvillea arguta（Royle）Royle］，标本存放在江西省药品检验检测研究院。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

取本品适量，粉碎，过四号筛，称取约0.5 g，置三角烧瓶中，加入乙酸乙酯溶剂15 mL，超声15 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1 mL 使其溶解，溶解液作为供试品溶液。另外称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇适量使溶解，制成每1 mL 含1 mg的对照品溶液。按照2020年版《中国药典》四部的薄层色谱方法进行实验，将供试品溶液1 µL，对照品溶液5 µL 点在同一块硅胶G 薄层板上。展开剂采用氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1），用10%硫酸乙醇溶液作为显色剂，喷完显色剂后，将薄层板放在105 ℃烘箱中加热至斑点显色清晰，放在365 nm的紫外灯光下检视，结果：在与对照品相对应的位置上，供试品出现与其相同颜色的荧光斑点，见图1。

图1 毛子草薄层色谱鉴别图

2.2 总灰分、酸不溶性灰分、水分和水溶性浸出物的分析

总灰分、酸不溶性灰分的检测采用2020年版《中国药典》四部灰分测定法；水分的检测采用2020年版《中国药典》四部的烘干法进行测定；水溶性浸出物的检测采用2020年版《中国药典》四部的热浸法测定［10］。19批毛子草药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的分析结果见表1。

表1 毛子草药材中灰分、水分和浸出物的检测结果（%）

2.3 车前醚苷的HPLC 含量测定

2.3.1 色谱条件色谱柱：CAPCELL PAK型C18 柱（5µm，4.6 mm×250 mm）；流动相:10%乙腈水溶液；流速：1.0 mL/min；测定波长：244 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。采用上述色谱条件进行检测，毛子草中成分车前醚苷与其他成分的色谱峰分离度良好。色谱图如图2 所示。

图2 车前醚苷（A）和毛子草药材（B）的HPLC图

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取车前醚苷对照品10 mg，放入50 mL 容量瓶中，用70%甲醇溶液进行溶解，得到每1 mL 含40 µg的车前醚苷对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备取毛子草药材（批号：2016-09-27）适量，粉碎，过四号筛，取约0.5 g，精密称定，置三角烧瓶中，精密加入50 mL70%甲醇溶液，密塞，称定重量，放在水浴上热回流30 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液对减少的重量进行补充，摇匀，过滤，用移液管精密吸取过滤液1 mL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.3.4 线性关系的考察精密称取车前醚苷对照品2.19 mg，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇溶液进行溶解，并加溶剂至刻度，摇匀，得车前醚苷的对照品溶液，分别吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、12 μL，采用“2.3.1”项下的色谱条件进行测定。以车前醚苷对照品进样量作为横坐标，其对应的色谱峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线图，回归方程为A=36.291 0X+0.166 7（r=0.999 9）。车前醚苷在0.043 8～0.525 9 μg之间显示良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验精密吸取“2.3.3”项下的供试品溶液10 μL，采用“2.3.1”项下的色谱条件连续测定样品6 次，记录样品的峰面积。结果车前醚苷峰面积的相对标准偏差RSD（n=6）为0.2%，表明所使用的仪器精密度良好。

2.3.6 重现性试验选取同一批次过4 号筛的毛子草粉末6 份，每份约0.5 g，精密称定，采用“2.3.3”项下的方法制作供试品溶液，应用“2.3.1”项下的色谱条件进行样品分析，车前醚苷的平均含量为18.349 5 mg/g，RSD 为1.6%，表明所建立的方法重现性较好。

2.3.7 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h 采集样品进行测定，记录峰面积，结果采集得到样品的车前醚苷峰面积的RSD（n=6）为0.4%，说明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.8 回收率试验取已知含量过4 号筛的毛子草药材粉末6 份，每份约0.25 g，每份精密加入含车前醚苷（0.087 6 mg/mL）的对照品溶液50 mL，采用“2.3.3”项下的制备方法制作供试品溶液，应用“2.3.1”项下的色谱条件进行样品分析，计算样品回收率。结果6 个样品车前醚苷的平均回收率为98.7%，RSD 为1.0%。

2.3.9 耐用性试验取同一批次过4 号筛的毛子草药材粉末约0.5 g，精密称定，按“2.3.3”项下的制备方法制作供试品溶液，选用CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）三种不同品牌的色谱柱按“2.3.1”项下的色谱条件测试样品，结果三种不同品牌的色谱柱测定的样品没有明显差别。

2.3.10 样品测定对收集的19批次不同时间采收的毛子草药材进行粉碎，过四号筛，每批次样品平行取2 份，然后采用“2.3.3”项下的制备方法制作供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.3.1”项下的色谱条件测试样品，记录峰面积，采用外标法计算19批毛子草药材中车前醚苷的含量，测试结果见表2。

表2 毛子草中车前醚苷的测定结果（%）

3 讨论

3.1 TLC 鉴别

毛子草现标准薄层鉴别采用毛子草对照药材进行对照，斑点存在拖尾现象，而且目前毛子草无法定对照药材，标准执行比较困难，通过对照品比对，确定毛子草对照药材薄层鉴别主斑点为齐墩果酸，通过比较不同比例的石油醚（60～90 ℃）∶环己烷∶醋酸乙酯∶冰醋酸（5∶4∶2.5∶0.1；6∶4∶2.0∶0.1）和氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1；30∶1∶0.1）等不同展开剂，结果表明采用氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1）作为齐墩果酸的展开剂，其斑点比较圆整清晰，且能完全分开。

3.2 测定波长的选择

取车前醚苷对照品溶液在400～200 nm 波长范围内进行光谱测定，结果车前醚苷在244 nm 波长显示最大吸收峰，并且244 nm 处的其他峰对车前醚苷峰无干扰，故选择244 nm 作为车前醚苷含量测定的测试波长。

3.3 提取方法的选择

分别对甲醇加热回流提取，甲醇超声提取2种提取法进行了比较。结果表明采用加热回流的提取方法，其提取效率大于采用超声提取的方法。对提取时间（30 min，60 min，90 min）和甲醇浓度（50%，70%，100%）也进行了比较，结果车前醚苷在30 min 即可提取完全，70%甲醇浓度提取效率高于其他比例。

3.4 色谱条件的优化

通过比较乙腈与水溶液，甲醇与水溶液作为流动相，以分离度为指标，结果以10%乙腈水溶液，柱温在30 ℃的条件下，毛子草药材中车前醚苷与其他色谱峰分离度良好。

本实验采用HPLC 法建立了毛子草药材中车前醚苷的含量测定方法，并采用TLC 法建立了毛子草药材专属性鉴别，同时对总灰分、酸不溶性灰分、水分、浸出物等理化指标进行了考察和检测，结果准确可靠。