气相色谱-一测多评法同时测定佛手挥发油中6种成分的含量

罗忻昳 李培 何兵 张春 张丹 田吉

中圖分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）16-1995-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.13

摘 要 目的：建立同时测定佛手挥发油中α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分含量的方法。方法：采用气相色谱-一测多评法。色谱柱为Agilent DB-17毛细管柱，检测器为火焰离子化检测器，载气为氮气（纯度99.999%），载气流速为0.5 mL/min，氮气（尾吹）流速为25 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min，进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃，程序升温，进样量为0.5 μL，分流比为35 ∶ 1。以柠檬烯为内参物，计算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4种成分的相对校正因子，再根据相对校正因子计算佛手挥发油中4种成分的含量，并与内标法（以十二烷为内标物，测定6种成分）进行比较。结果：α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇检测质量浓度的线性范围分别为0.030 5～0.213 8、0.066 6～0.466 0、0.021 8～0.152 3、0.765 2～5.356 4、0.387 3～2.710 8、0.034 2～0.239 6 mg/mL（r均大于0.999）;检测限分别为4.82、7.89、4.01、4.54、5.53、2.47 ?g/mL，定量限分别为15.34、25.91、13.69、15.70、18.68、8.36 ?g/mL;精密度、重复性、稳定性（24 h）试验的RSD均小于2%;平均加样回收率分别为96.08%、97.48%、100.90%、101.22%、100.54%、95.84%（RSD均小于3%，n=6）。α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯的平均相对校正因子分别为0.997 8、1.530 7、0.952 4、1.025 5（RSD均小于1%）。内标法测得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇的含量分别为3.296 9～20.994 1、11.300 6～39.440 9、3.684 2～11.291 4、174.857 8～511.611 8、0～285.127 3、0～48.858 6 mg/g;一测多评法测α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯的含量分别为3.296 8～20.994 0、11.300 3～39.439 7、3.684 1～11.291 1、0～285.126 6 mg/g;两种方法测得α-蒎烯等4种成分含量的相对误差均小于1%。结论：所建气相色谱-一测多评法简便、快捷，准确度高，重复性好，可用于佛手挥发油成分的定量分析及质量控制。

关键词 佛手挥发油;气相色谱法;一测多评法;含量测定

Simultaneous Determination of 6 Components in Volatile Oil from Citrus medica by GC-QAMS

LUO Xinyi，LI Pei，HE Bing，ZHANG Chun，ZHANG Dan，TIAN Ji（School of Pharmacy， Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol in volatile oil from Citrus medica. METHODS： GC-QAMS method was adopted. The determination was performed on Agilent DB-17 capillary column. Flame ionization detector was adopted with nitrogen as carrier gas （purity 99.999%） at the flow rate of 0.5 mL/min. The flow rate of nitrogen （make-up gas） was 25 mL/min， the flow rate of hydrogen was 30 mL/min， and the flow rate of air was 400 mL/min. The inlet temperature was 250 ℃， and the detector temperature was 280 ℃ （programmed temperature）， and injection volume was 0.5 μL with split ratio of 35 ∶ 1. Using limonene as internal reference， relative correction factors of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene were calculated. The contents of 4 components in the samples were calculated according to the relative correction factors. The results were compared between QAMS and internal standard method （ISM， using dodecane as internal substance， 6 components to be determined）. RESULTS： The linear range of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol were 0.030 5-0.213 8， 0.066 6-0.466 0， 0.021 8-0.152 3， 0.765 2-5.356 4， 0.387 3- 2.710 8， 0.034 2-0.239 6 mg/mL （all r>0.999）. The limits of detection were 4.82， 7.89， 4.01， 4.54， 5.53， 2.47 ?g/mL， and the limits of quantification were 15.34， 25.91， 13.69， 15.70， 18.68， 8.36 ?g/mL， respectively. RSDs of precision， repeatability and stability tests （24 h） were all less than 2%. The average recovery rates were 96.08%， 97.48%， 100.90%， 101.22%， 100.54%， 95.84% （all RSD<3%， n=6）. The average relative correction factors of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene were 0.997 8， 1.530 7， 0.952 4 and 1.025 5 （all RSD<1%）. The contents of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol by ISM were 3.296 9-20.994 1， 11.300 6-39.440 9， 3.684 2-11.291 4， 174.857 8-511.611 8， 0-285.127 3， 0-48.858 6 mg/g， respectively. The contents of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene determined by QAMS were 3.296 8-20.994 0， 11.300 3- 39.439 7， 3.684 1-11.291 1， 0-285.126 6 mg/g， respectively. Relative content errors of 4 components as α-pinene determined by 2 methods were all less than 1%. CONCLUSIONS： The established GC-QAMS method is simple， rapid， accurate and repeatable， and can be used for quantitative analysis and quality control of volatile oil from C. medica.

KEYWORDS   Volatile oil from Citrus medica; GC; QAMS; Content determination

佛手为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle 的干燥果实，收载于2020年版《中国药典》（一部），具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰之功[1]。佛手主产于我国广东、四川、浙江等地，根据产地不同被称为广佛手、川佛手和浙佛手等[2]，主要含挥发油、黄酮、香豆素和多糖等成分[3]。佛手外皮为黄绿色或橙黄色，有皱纹和油点，气香，是挥发油的主要来源[1]。近年来，关于佛手挥发油药理作用的报道逐渐增多，且研究显示其具有抑菌[4]、止咳平喘祛痰[5]、抗抑郁[6]、抗肿瘤[7-9]等作用，现已被广泛用于香水、化妆品、医药、食品等行業。此外，佛手挥发油还可用于芳香疗法，用于调节患者情绪和改善轻微的应激障碍症状，如焦虑、抑郁、痴呆症的行为障碍和慢性疼痛等[10]。目前关于佛手挥发油的研究主要集中在成分分析方面，有学者采用气质联用技术（GC-MS）分析了不同产地佛手挥发油的成分，结果表明，佛手挥发油中含有萜烯类及其含氧衍生物，其中柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分在佛手挥发油中的含量较高[11-16];有研究指出，柠檬烯是佛手挥发油的主要成分，具有抗炎、抗焦虑、抑制细胞增殖、抗肿瘤等作用[17]。此外，α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、α-松油醇等也具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化以及抗哮喘等多种药理作用[18-20]。

2020年版《中国药典》（一部）中佛手“含量测定”项仅规定以高效液相色谱法测定橙皮苷的含量[1]。本课题组前期虽然采用气相色谱法（GC）测定了佛手挥发油中主成分柠檬烯的含量[21]，但考虑到挥发油是由多种萜类成分组成的有效部位，故单一成分的含量测定不能完全反映挥发油的整体质量。现代中药质量评价提倡采用多指标质量控制模式，对对照品的种类和数量需求均较大[22]，而一测多评法（QAMS）可通过单一对照品而实现对多个成分的同步检测，检测成本大大降低[22]，但文献报道的QAMS相关研究以液相色谱法居多[23-24]。基于此，本研究采用气相色谱-一测多评 法（GC-QAMS）测定佛手挥发油中α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等成分的含量，旨在为佛手药材及其挥发油的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Agilent 7890A型GC仪、Agilent 8890型GC仪（美国Agilent公司），岛津GC-2030型GC仪（日本shimadzu公司），XR 205SM-DR型十万分之一电子天平（瑞士Precisa公司）。

1.2 主要药品与试剂

α-蒎烯对照品（批号00016834-424，纯度98.9%）、α-松油醇对照品（批号00020105-FMC，纯度98.0%）均购自美国ChromaDex公司;β-蒎烯对照品（批号131559，纯度99.5%）购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;月桂烯对照品（批号BCBW0611，纯度93.0%）、γ-松油烯对照品（批号STBH9503，纯度98.8%）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;柠檬烯对照品（批号100470-201503，纯度96.0%）购自中国食品药品检定研究院;十二烷对照品（内标，批号K1920078，纯度99.7%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酸乙酯为分析纯，水为超纯水。

23批佛手药材（编号S1～23）均购自原产地，经西南医科大学药学院张春教授鉴定为佛手芸香科植物佛手C. medica L. var. sarcodactylis Swingle 的干燥果实。采用水蒸气蒸馏提取法制备佛手挥发油（共23批，以无水硫酸钠去除挥发油中的残余水分，得率为0.2%～1.0%）。佛手药材信息来源见表1。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 单一对照品贮备液 精密称取α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇对照品76.34、83.22、90.68、191.30、203.82、90.06 mg，分别置于10 mL量瓶中，加入乙酸乙酯溶解，制成上述6种成分质量浓度分别为7.634、8.322、9.068、19.130、20.382、9.006 mg/mL的单一对照品贮备液。

2.1.2 内标溶液 精密称取十二烷对照品适量，加入乙酸乙酯溶解，混匀，制成质量浓度为7.327 mg/mL的内标溶液。

2.1.3 混合对照品溶液 分别精密量取“2.1.1”项下6种单一对照品贮备液400、800、240、4 000、1 900、380 μL，置于10 mL量瓶中，加入乙酸乙酯定容，混匀，得各成分质量浓度分别为0.305 4、0.665 8、0.217 6、7.652 0、3.872 6、0.342 2 mg/mL的混合对照品贮备液。精密量取上述贮备液5 mL及“2.1.2”项下内标溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容至10 mL，混匀，即得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇、十二烷质量浓度分别为0.152 7、0.332 9、0.108 8、3.826 0、1.936 3、0.171 1、0.732 7 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液 精密称取佛手挥发油0.1 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”项下内标溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容，混匀，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent DB-17毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;检测器为火焰离子化检测器;载气为氮气（纯度99.999%），载气流速为0.5 mL/min;氮气（尾吹）流速为25 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min;进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃，程序升温（起始温度50 ℃，以5 ℃/min升温至60 ℃，再以2 ℃/min升温至100 ℃，然后以20 ℃/min升温至250 ℃，保留5 min）;进样量为0.5 μL，分流比为35 ∶ 1。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液以及空白对照溶液（乙酸乙酯），按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，各待测成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数按柠檬烯峰计均不低于100 000，空白对照对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.1.3”项下混合对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于2 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”项下内标溶液0.2 mL，加入乙酸乙酯定容，混匀，得不同质量浓度的系列线性溶液（表2），按“2.2”项下色谱条件进样，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、各成分与内标的峰面积比值（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表3。

2.5 检测限与定量限考察

取“2.1.3”项下混合对照品溶液，用乙酸乙酯逐级稀释，按“2.2”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1计算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分的检测限与定量限。结果，上述6种成分的检测限分别为4.82、7.89、4.01、4.54、5.53、2.47 ?g/mL，定量限分别为15.34、25.91、13.69、15.70、18.68、8.36 ?g/mL。

2.6 精密度试验

精密量取“2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分与内标的峰面积比值。结果，上述6种成分与内标峰面积比值的RSD分别为0.37%、0.55%、1.09%、0.13%、0.07%、0.11%（n=6），表明仪器精密度较好。

2.7 重复性试验

取佛手挥发油样品（批号20191028），按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分与内标的峰面积比值，并按内标法计算样品中上述6种成分的含量。结果，上述6种成分含量的RSD分别为0.71%、1.07%、1.51%、0.72%、0.66%、0.82%（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取“2.1.4”项下供试品溶液（批号20191028），分别于室温下0、2、4、8、16、24 h时按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种成分与内标的峰面积比值。结果，上述6种成分与内标峰面积比值的RSD分别为0.74%、0.58%、1.02%、0.41%、0.56%、0.23%（n=6），表明佛手挥发油供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

分别精密称取已知含量的佛手挥发油（批号20191028）50 μL（约0.043 g），共6份，置于10 mL量瓶中，分别精密加入“2.1.1”项下α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6种单一对照品贮备液100、190、54、1 040、480、90 μL，精密加入“2.1.2”项下内标溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录各待测成分与内标的峰面积比值并计算加样回收率，结果见表4。

2.10 QAMS法的建立

2.10.1 相对校正因子的计算 取“2.4”项下系列线性溶液（质量浓度与表2中各浓度梯度对应），按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以柠檬烯为内参物（因柠檬烯为佛手挥发油的主要成分，具有多种药理活性，含量较高且对照品价格便宜，故选择柠檬烯为内参物），计算其余4种成分的相对校正因子（fk/s）：fk/s=（Cs×Ak）/（Ck×As）。式中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰峰面积，Ck为其余成分质量浓度，Ak为对照成分色谱峰峰面积。具体结果见表5（因采用内标法和QAMS法时α-松油醇的结果差异较大，RSD>3%，不适用于   QAMS法测定，故未纳入）。

2.10.2 相对校正因子的耐用性考察 取“2.4”项下系列线性溶液，按“2.2”项下色谱条件分别以不同色谱仪（Agilent 7890A型、Agilent 8890型、岛津GC-2030型GC仪）、不同品牌色谱柱（Agilent DB-17、岛津 InertCap 17、岛津 WondaCap 17，规格均为30 m×0.32 mm，0.25 μm，下同）进样。结果，以Agilent 7890A型、Agilent 8890型GC仪以及不同品牌色谱柱得到的相对校正因子变化均较小，可共用;虽然以岛津GC-2030型GC仪在不同品牌色譜柱上的相对校正因子变化也较小，但与上述两种GC仪比较，所得相对校正因子差异较大，提示同一厂家仪器的相对校正因子耐用性较好;同一色谱仪在不同品牌色谱柱上所得的相对校正因子差异较小，耐用性好，详见表6。此外，由于3种不同品牌色谱柱以Agilent DB-17的分离度、峰形更好，基线更平稳，故选择Agilent DB-17色谱柱进行后续考察。

2.10.3 不同仪器对含量的影响 取佛手挥发油（批号20191028），按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2” 项下色谱条件进样测定，按各自的相对校正因子计算α-蒎烯等4种成分的含量，每样品平行测定3次。结果，内标法和QAMS法以不同仪器所得含量测定结果基本一致，RSD<2%，详见表7。

2.10.4 待测成分色谱峰定位 以柠檬烯峰的保留时间为参照，计算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯及γ-松油烯峰的相对保留时间，考察不同色谱仪（Agilent 7890A型、Agilent 8890型、岛津GC-2030型GC仪）、色谱柱（Agilent DB-17、岛津 WondaCap 17、岛津 InertCap 17）对相对保留时间的影响。结果，不同型号仪器、不同色谱柱对4种成分相对保留时间的影响均不明显，RSD为0.20%～1.41%，提示可以通过相对保留时间来定位待测成分的色谱峰，详见表8。

2.11 含量测定

分别精密称取23批佛手挥发油各100 μL，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别以内标法和QAMS法计算含量，每样品平行测定3次，取平均值，结果见表9。

由表9可知，各批次佛手挥发油中，两种方法所得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4种成分含量的相对误差（RE）均小于1%（以每批样品计），表明所得结果无明显差异。

3 讨论

本课题组前期对Agilent DB-5、Agilent DB-17两种不同极性的色谱柱进行了考察，结果发现，当以Agilent DB-5为色谱柱时，佛手挥发油中多数成分的分离效果较好，但柠檬烯峰后面有个小峰（基本包进了柠檬烯峰中），经反复调整色谱条件也不能将之与柠檬烯基线分离。采用Agilent DB-17色谱柱后，柠檬烯与后面的小峰达到基线分离，色谱图中的大部分峰的分离效果较好，但β-蒎烯峰与月桂烯峰保留时间相近，易重合，未达到基线分离，经反复试验，最终通过降低初始温度实现基线分离，得到各成分分离均较好的色谱图，故最终选择Agilent DB-17为色谱柱。载气流速通常选用1 mL/min，但因十二烷峰旁边有小色谱峰，二者未能分开;当将载气流速调为0.5 mL/min后，十二烷峰峰形较好，且与相邻色谱峰基线分离。

外标法简便但要求进样量十分准确，要严格控制在与标准物相同的色谱条件下进行，否则易造成分析误差;内标法测定结果准确，由于内标物与待测成分峰面积的比值不受进样量波动的影响，因而在一定程度上消除了操作条件等变化所引起的误差[25-26]，但内标物的选择很重要。本课题组前期在参考文献[27]的基础上，分别选择萘、正十一烷、十二烷为内标物，结果发现，十二烷在GC图谱中的出峰时间与前后相邻峰相差较大，分离度好，且十二烷的保留时间在6种待测成分之间，故选择十二烷为内标物。

由于α-松油醇的相对保留时间在不同色谱柱中相差较大，无法准确定位，且采用QAMS法与内标法计算所得的含量相差亦较大，故未采用QAMS法检测α-松油醇的含量，最终采用QAMS法测定其他4种成分的含量。本研究结果显示，QAMS法和内标法所得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4种成分含量的RE均小于1%，两种方法比较无明显差异。

综上所述，所建GC-QAMS法简便、快捷，准确度高，重复性好，可用于佛手挥发油成分的定量分析及质量控制。

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（收稿日期：2021-04-20 修回日期：2021-07-16）

（编辑：陈 宏）