徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞迁移和凋亡及相关蛋白表达的影响

秦桂福 吴琪 宋玉 吴高明 李俟琪

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一种间叶组织来源的好发于儿童和青少年的骨骼系统恶性肿瘤，保肢手术和新辅助化疗的综合治疗是骨肉瘤患者常用的治疗手段，化疗药物对杀伤肿瘤细胞、预防肿瘤复发具有重要意义[1-2]。临床上常用的骨肉瘤化疗药物如顺铂(Cisplatin)具有肾毒性和严重呕吐的毒副作用及肿瘤耐药性，限制其长期使用，是影响化疗效果的主要因素[3]。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤药物，降低传统化疗药物的使用剂量，可为骨肉瘤的治疗提供更好的策略和方向[4]。

萝藦科植物徐长卿的根及根茎或带根全草，性温、味辛，归肝、胃经，有较强的祛风止痛、温经通络和解郁活血的功效，丹皮酚是徐长卿的主要有效成分，研究发现其在体外对多种肿瘤细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用[5]。PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达失调与肿瘤细胞增殖分化、肿瘤血管形成转移、化疗耐药性关系密切[6-7]。本研究通过探讨徐长卿丹皮酚(Paeonol)联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响，揭示PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化与骨肉瘤细胞增殖、迁移和凋亡的关系，为临床上徐长卿丹皮酚和顺铂的联合用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

徐长卿丹皮酚(上海阿拉丁公司，批号H111081，纯度>99%)；顺铂(美国Sigma公司，批号P4394，纯度>99%)；0.25% Trypsin、胎牛血清(美国Gibco公司，批号分别为15050065和10099-141)；CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(美国MCE公司，批号HY-K0301)；Transwell(美国BD Biosciences公司，批号353097)；多聚甲醛、TEMED、SDS(国药集团化学试剂有限公司，批号分别为80096618、80125336、30166428)；细胞凋亡检测试剂盒(南京Vazyme有限公司，批号A113-03)；DAPI、磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C1002、S1873、P0013B、P0010)；抗荧光淬灭封片剂(美国Southernbiotech公司，批号0100-01)；Trise-Base(德国Biofroxx公司，批号1115GR500)；蛋白marker(上海百赛生物技术有限公司，批号P12103-2)；PVDF膜(美国Millipore公司，批号IPVH00010)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司，批号AB-P-R 001)；兔单抗p-Akt、兔单抗mTOR(美国CST公司，批号分别为13038、2983S)；兔多抗Akt(江苏亲科生物研究中心有限公司，批号AF6261)；兔单抗p-mTOR(英国Abcam公司，批号Ab137133)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，批号BA1054)；ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司，批号P1050)。

1.2 仪器

ThermoFisher微量移液器、5702R型低速离心机(德国Eppendorf公司)；MCO-15AC型CO2恒温培养箱(日本SANYO电气公司)；Flexstation©3型全自动酶标仪(美国Molecular Devices分子仪器公司)；IX51型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；德国Leica RM 2016轮转式切片机；武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机；DYCZ-40型电转仪、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器厂)；mμlISKANMK3酶标仪(美国Thermo公司)；T8-1型磁力搅拌器(江苏省金坛市中大仪器厂)；TS-1水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；CPA电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.3 细胞

骨肉瘤细胞系MG-63，购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司，货号CL-0157，传至第3～5代用于实验。

1.4 方法

1.4.1细胞培养 取生长状态良好的MG-63细胞，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及链霉素的DMEM/F12培养液，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行各项实验。

1.4.2CCK8比色法检测细胞活力 以5×104个/mL密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)。分为6组：空白组(不加药物)、顺铂(4 μmol/L)组、徐长卿丹皮酚(0.3 mmol/L)组、徐长卿丹皮酚不同浓度(0.3，0.6，1.2 mmol/L)联合顺铂(4 μmol/L)组；每组5个复孔，37 ℃分别培养24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养4 h，酶标仪测定各孔吸光值OD 450，根据公式计算细胞活力。计算公式：增殖抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。计算两药相互作用指数(Coefficient of Drug Interaction，CDI)，公式为[8]CDI=AB/(AXB)，AB=两药联合组A值/对照组A值；A(或B)=两药单独使用组A值/对照组A值。CDI<1时两药有协同作用，CDI<0.7时协同作用非常明显。

1.4.3细胞划痕法检测MG-63细胞迁移 取已按1.4.2节分组处理完毕的各组细胞，0.25%胰酶分别消化计数约为5×105个细胞，接种于6孔板，确保第2天可以铺满，将枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养，分别在0 h和24 h拍照，用Image-Pro Plus 软件分析，以最大距离与最小距离的平均值来评估细胞迁移程度。

1.4.4Transwell法检测MG-63细胞侵袭 细胞分组同1.4.2节，细胞培养24 h后收集细胞，0.25%胰酶消化，终止消化后离心去上清，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5×104个/mL，在24孔板中预先加入800 μL含10%FBS 的培养基(含双抗)，并放入Transwell小室，1 h后在Transwell上室分别接入200 μL各组细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后取出，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，用10%甲醇溶液固定细胞30 min。切膜后用5%结晶紫染液染色20 min，PBS清洗后显微镜下观察，拍照计数。

1.4.5TUNEL法检测MG-63细胞凋亡 细胞分组同1.4.2节，细胞培养24 h后收集细胞，将爬好细胞的玻片浸入4%多聚甲醛溶液，室温固定25 min后用PBS洗涤3次。每个爬片滴加100 μL浓度为20 μg/mL的Proteinase K溶液，室温孵育20 min。用去离子水溶液润洗爬片，滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育15 min。在平衡细胞的同时在冰上解冻BrightRed Labeling Mix，准备TdT孵育缓冲液。将载玻片置于湿盒内，在37 ℃下孵育60 min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光，用PBS洗涤3次。滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行复染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.4.6Western Blot法检测MG-63中Akt和mTOR的蛋白磷酸化水平 将实验分为6组：空白组(不加药物)、顺铂(4 μmol/L)组、徐长卿丹皮酚(0.3 mmol/L)单独组、徐长卿丹皮酚不同浓度(0.3，0.6，1.2 mmol/L)联合顺铂(4 μmol/L)组。细胞培养24 h后收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白，于4 ℃下12 000 r/min离心5 min后收集上清为蛋白悬浮液。将蛋白样品和BSA标准蛋白进行适当稀释后，加入BCA试剂盒混合液，用DG-3022A酶标仪测定OD568，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。采用加热法进行蛋白变性，用10%SDS-PAGE进行电泳。取出凝胶根据Marker切下目的条带，将蛋白转移到PVDF膜上。用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭2 h，分别加入GAPDH(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜。用TBST充分洗涤PVDF膜，再加入用HRP标记的二抗(1∶50 000稀释)，室温摇床孵育2 h。TBST洗膜后，ECL显影、定影，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 徐长卿丹皮酚联合顺铂增强抑制骨肉瘤细胞增殖

CCK8结果显示，与空白组比较，徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂组、顺铂和徐长卿丹皮酚单独给药组随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率有不同程度的增加，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与顺铂组比较，徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂各组细胞增殖抑制率逐渐增加，呈时间和浓度依赖性，两药存在协同作用，CDI<1，且作用72 h后徐长卿丹皮酚1.2 mmol/L联合顺铂对骨肉瘤细胞增殖抑制作用最强，差异有统计学意义(P<0.01)，CDI<0.7，协同效应非常明显。提示徐长卿丹皮酚和顺铂联合给药可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，其抑制作用与徐长卿丹皮酚浓度及作用时间相关，且明显强于顺铂和徐长卿丹皮酚单独给药组(见表1)。

表1 各组骨肉瘤细胞增殖抑制率

2.2 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞迁移的影响

细胞划痕实验结果显示徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂给药可显著抑制骨肉瘤细胞迁移，并具有一定的浓度依赖性，其抑制作用强于顺铂和徐长卿丹皮酚单独给药组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2及图1。

表2 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞迁移的影响

图1 徐长卿丹皮酚增强顺铂抑制骨肉瘤细胞迁移能力

2.3 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞侵袭的影响

与空白组比较，各药物组细胞的侵袭数目均显著减少，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。与顺铂组比较，徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂给药可以显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，并具有一定的浓度依赖性，见表3及图2。

图2 徐长卿丹皮酚增强顺铂抑制骨肉瘤细胞侵袭能力(200×)

表3 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞侵袭的影响

2.4 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞凋亡的影响

不同浓度徐长卿丹皮酚联合顺铂作用骨肉瘤细胞24 h，荧光显微镜下观察4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后MG-63细胞核的形态变化，可见空白组细胞核为椭圆形蓝色均匀荧光，随着徐长卿丹皮酚浓度的增加，呈红色荧光凋亡细胞明显增多，以徐长卿丹皮酚中、高浓度与顺铂联用最明显。与空白组比较，各药物组骨肉瘤细胞的凋亡率均显著升高(P<0.05，P<0.01)。与顺铂组比较，徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂给药随着药物浓度升高，细胞凋亡率呈升高趋势(P<0.05，P<0.01)，具有一定的浓度依赖性(见表4及图3)。

表4 各组骨肉瘤细胞凋亡率

图3 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞凋亡的影响(200×)

2.5 徐长卿丹皮酚联合顺铂对MG-63细胞中Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影响

Western Blot结果表明：徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂干预24 h后，Akt、mTOR蛋白的表达水平变化不明显；p-Akt、p-mTOR表达水平随徐长卿丹皮酚浓度增大而减少，提示徐长卿丹皮酚联合顺铂可显著抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，具有一定的浓度依赖性，并且其抑制作用强于顺铂单独给药组(P<0.01)，见图4。

图4 徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞中AKT和mTOR蛋白磷酸化水平的影响

3 讨论

近年来随着对骨肉瘤病理、影像及药理等研究的深入，临床上对于局限性骨肉瘤患者，经规范诊疗后5 a生存率可达60%，然而因其具有高转移和增殖能力，临床治疗中容易复发、治疗效果不佳[9-10]。化疗药物的毒副作用及肿瘤多药耐药性是导致化疗失败的主要原因。中药在治疗骨肉瘤方面历史悠久，从中寻找治疗骨肉瘤的药物有广阔的应用前景[11]。

文献报道显示[12]，徐长卿是经动物实验和临床验证后对骨肿瘤有肯定疗效的药物之一，是骨肿瘤中医证候分型中湿毒留滞型、瘀血内阻型和瘀毒热结型的配伍方药[13]，主要药理成分丹皮酚药理作用广泛，包括解热镇痛、抗炎、抗氧化、调节细胞免疫、抑制血小板聚集、抗血栓形成及中枢抑制作用，且其不良反应少，而近年来丹皮酚的抗肿瘤活性逐渐被证实。研究发现，丹皮酚能抑制人肝癌细胞Bel-7404的增殖，诱导其凋亡，其作用机制可能与通过抑制PI3K通路，上调抑癌基因PTEN的表达，下调抑癌基因Akt的表达有关[14]。研究证实，丹皮酚能显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能和调控凋亡相关蛋白Survivin、Caspase-3的表达变化相关[15]。研究表明，丹皮酚通过诱导细胞凋亡抑制乳腺癌细胞生长，其机制可能与启动线粒体凋亡途径有关[16]。

本研究用不同浓度的徐长卿丹皮酚(0.3，0.6，1.2 mmol/L)联合顺铂处理骨肉瘤MG-63细胞后，CCK-8结果显示，与空白对照组和顺铂单独给药组相比，徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂各组细胞增殖抑制率逐渐增加，呈时间和浓度依赖性，且作用72 h后徐长卿丹皮酚1.2 mmol/L联合顺铂对骨肉瘤细胞增殖抑制作用最强，CDI<0.7，说明徐长卿丹皮酚联合顺铂有协同抑瘤作用。用细胞划痕和Transwell实验检测不同浓度徐长卿丹皮酚联合顺铂对MG-63细胞迁移和侵袭的影响，结果显示联合用药可以显著抑制骨肉瘤细胞的迁移能力和侵袭能力，并具有一定的浓度依赖性，且其抑制作用强于顺铂单独给药组。用TUNEL法检测MG-63细胞凋亡，随着徐长卿丹皮酚浓度的增加，呈红色荧光凋亡细胞有明显增多的趋势，以徐长卿丹皮酚中、高浓度与顺铂联用最明显，结果提示徐长卿丹皮酚协同顺铂促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡。

为进一步探讨徐长卿丹皮酚联合顺铂协同抗骨肉瘤的作用机制，用Western Blot法检测骨肉瘤MG-63中PI3K/Akt/mTOR通路相关信号蛋白Akt和mTOR的磷酸化水平，结果表明：徐长卿丹皮酚联合顺铂可能通过抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化，发挥协同抑瘤作用，并具有一定的浓度依赖性，但对Akt、mTOR总蛋白表达无影响。