丙烯酰胺对小鼠血液毒性的研究

王小博,梁斯,陈齐,郑琳*,俞鸣铗,刘健南,陈冰冰

(1.佛山职业技术学院食品科学系,广东 佛山 528137;2.佛山市疾病预防控制中心,广东 佛山 528000)

丙烯酰胺(acrylamide)是一种白色晶体,易溶于水、乙醇、甲醇等极性溶剂,在工业上被广泛应用为生产聚丙烯酰胺及其同聚物的中间体[1]。丙烯酰胺是一种中等毒性的毒物,极易被生物体的消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收,引起急慢性中毒[2-3],其具有神经毒性、生殖毒性、致畸性和致癌性[4-5]。丙烯酰胺是美拉德反应的一种副产物,研究发现,一些油炸、焙烤的淀粉类食品中存在大量的丙烯酰胺[6]。近年来丙烯酰胺对人体健康的影响越来越受到大家的关注,丙烯酰胺的毒性效应也越来越受到大家的重视。目前针对丙烯酰胺毒性的研究主要集中在其神经毒性,而丙烯酰胺对生物机体血液毒性的研究鲜有报道。本实验通过不同剂量丙烯酰胺灌胃小鼠,记录体重、器官指数变化,对血液相关指标检测分析,以此来识别丙烯酰胺对小鼠血液毒性作用,为研究丙烯酰胺潜在危害提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48只(雌雄各半)4~6周龄SPF级KM小鼠,体重20~30 g,购于广西医科大学实验动物中心【SCXK(桂)2020-0004】,实验小鼠饲养于广西医科大学实验动物中心【SYXK(桂)2020-0003】。饲养环境通风良好,饲养期间各组小鼠均提供充足饮水和饲料,室温18~25℃,相对湿度40%~70%,12 h光照昼夜循环。待小鼠适应环境1周后,进行实验。所有操作均获得广西医科大学动物实验伦理委员会的批准(批准号:201808009)。

1.1.2 主要试剂与仪器

丙烯酰胺标准品(Enzo,USA,纯度≥98%)购自于上海颖心实验室;碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(VREA)、尿酸(UA)检测试剂盒购自西宝生物科技(上海)股份有限公司。

酶标仪(Multiskan FC,Thermo,美国);台式冷冻离心机(Universal320,Hettich,德国);血常规分析仪(URIT-2981,武汉医盾医疗器械有限公司,中国);电子天平(PGC-453E,艾德姆衡器武汉有限公司,中国);恒温水浴锅(HH-4,金坛市华城开元实验仪器厂,中国)。

1.2 方法

1.2.1 分组和给药方式

将体重相当、健康的SPF级KM小鼠随机分为6大组,每组8只。丙烯酰胺的半数致死剂量一般高于150 mg/kg[7],因此本研究设定不同剂量的丙烯酰胺(30、60、90、120、150 mg/kg),采用经口灌胃方式对实验动物连续染毒16 d,每10 g体重灌胃0.1 mL丙烯酰胺溶液。对照组灌胃同等体积的生理盐水,每日灌胃1次,实验期间小鼠正常喂食、饮水。

1.2.2 小鼠形态观察和增重率测定

每天定时观察并记录小鼠的采食量及精神状态。在每天灌胃和喂食之前,称量体重,计算每天的增重率。

式中:Wi为第i天小鼠体重(g);W0为实验初始时小鼠体重(g)。

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1.2.3 小鼠血液指标血常规分析

第17天对小鼠尾部采血30~40μL,并立即进行血常规检测。

1.2.4 小鼠血液相关生化指标的测定

第17天对小鼠眼部取血并处死,分离其心、肝、脾、胃、肾、肺称重后计算各剂量组小鼠的器官系数,并测定血清中AST、ALT、AKP、BUN、CREA、UA指标。

1.3 统计学分析

实验数据使用SPSS Statistics 19.0软件进行处理,采用ANOVA中的LSD多重比较进行分析,所有数据均为平均值±标准差(±s)表示,P<0.05表示为差异具有显著性;通过Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果

2.1 小鼠形态观察和体重增长率测定

实验过程中,对照组小鼠摄食,饮水正常,精神状态较好;实验初期染毒组小鼠摄食,饮水正常,第8天后,各染毒组小鼠摄食减少,高剂量组(120、150 mg/kg)小鼠活动减少,精神萎靡;实验结束后,各剂量组小鼠体重均有所增加;与对照组相比,当染毒剂量为120、150 mg/kg时,小鼠体重增重率变化显著(P<0.05)(见图1)。

图1 染毒小鼠增重率变化Note.Compared with the control group,*P<0.05.Figure 1 Change of weight gain rate in mice exposed

2.2 丙烯酰胺对小鼠器官系数的影响

与对照组比,不同剂量组小鼠的心、脾、胃、肺器官系数略有下降(见表1),但无明显差异(P>0.05),说明了当丙烯酰胺浓度<150 mg/kg时,对小鼠的心、脾、胃、肺器官未有明显的毒性作用。与对照组比,当染毒剂量为120、150 mg/kg时,小鼠肝系数显著下降(P<0.05);当染毒剂量为90、120、150 mg/kg时,小鼠肾系数显著下降(P<0.05)。

表1 丙烯酰胺对小鼠器官系数的影响(n=8)Table 1 Effect of acrylamide on the organ coefficient of mice(n=8)

2.3 小鼠白细胞系统分析

连续灌胃16 d后,小鼠血液中WBC、LYM随着染毒浓度的增加逐步下降,GRAN随着染毒浓度的增加而增加(见表2)。与对照组相比,当染毒剂量为120、150 mg/kg时,WBC、LYM下降显著(P<0.05);当染毒剂量为120、150 mg/kg时,GRAN显著增加(P<0.05)。由此说明,高浓度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)会对小鼠的白细胞系统产生明显的毒性效应。

表2 丙烯酰胺对小鼠白细胞系统的影响(n=8)Table 2 The effect of acrylamide on the white blood cell system of mice(n=8)

2.4 小鼠红细胞系统分析

连续灌胃16 d之后,小鼠红细胞系统中RBC、HGB、MCV、MCH、MCHC等各项指标与试验之前相比呈轻微下降趋势(见表3)。与对照组比,当染毒剂量为120、150 mg/kg时,RBC、MCHC下降显著(P<0.05);当染毒剂量为90、120、150 mg/kg时,HGB下降显著(P<0.05);当染毒剂量为150 mg/kg时,MCV下降显著(P<0.05)。结果表明,中高浓度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)对小鼠的红细胞系统产生较大的毒性作用。

表3 丙烯酰胺对小鼠红细胞系统的影响(n=8)Table 3 Effect of acrylamide on the red blood cell system of mice(n=8)

2.5 小鼠血小板系统分析

分别连续灌胃16 d之后,随着染毒剂量的增加小鼠血小板系统中PLT、PCT和P-LCR均下降(见表4)。与对照组比,当染毒剂量为120、150 mg/kg时,PLT、P-LCR下降显著(P<0.05);当染毒剂量为150 mg/kg时,PCT显著下降(P<0.05)。由此说明,高浓度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)会对小鼠的血小板系统带来一定得毒性效应。

表4 丙烯酰胺对小鼠血小板系统的影响(n=8)Table 4 Effect of acrylamide on the platelet system of mice(n=8)

2.6 小鼠血清生化指标的测定

如图2所示随着染毒剂量的增加,小鼠血清中的ALT活性也随之增加,与对照组相比,当染毒剂量为90、120 mg/kg时,ALT酶活性显著升高(P<0.05),当染毒剂量为150 mg/kg时,ALT酶活性升高极显著(P<0.01)。小鼠血清中的AST活性随着染毒剂量的增加,呈现先上升后下降的趋势;当染毒剂量为60 mg/kg时,AST活性达到最大;与对照组相比,AST活性增加极其显著(P<0.01)。小鼠血清中的AKP活性随着染毒剂量的增加也随之增加,与对照组相比,当染毒剂量≥60 mg/kg时,AKP活性增加显著(P<0.05),当染毒剂量为90、120 mg/kg时,AKP活性增加极显著(P<0.01)。当染毒剂量为120 mg/kg时,BUN含量达到最大,与对照组相比增加极显著(P<0.01)。随着染毒剂量的增加,CREA、UA含量随之增加;当染毒剂量≥60 mg/kg时,CREA含量增加显著(P<0.05);当染毒剂量≥90 mg/kg时,UA含量也显著增加(P<0.05);当染毒剂量为120、150 mg/kg时,CREA、UA含量增加极显著(P<0.01)。结果表明,丙烯酰胺会引起小鼠血清各指标发生变化,可作为丙烯酰胺毒性效应的标志物,剂量越高,反应越明显。

图2 丙烯酰胺对小鼠血清生化指标的影响(n=8)Note.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 2 Effect of acrylamide on serum biochemical indexes in mice(n=8)

3 讨论

丙烯酰胺是食品加工过程中形成的一种主要的内源污染物,可在食品中残留,进而导致食源性中毒。本研究对丙烯酰胺的血液毒性进行系统的评估,为丙烯酰胺毒性机理研究提供数据资料。研究表明经口剂量大于100 mg/kg时,丙烯酰胺能够产生明显的急性中毒效应[8],这与本研究实验结果基本一致。

丙烯酰酰胺能够刺激小鼠β-细胞,导致胰岛素分泌不足,进而促使小鼠的进食量增多,体重增加[9];同时,丙烯酰胺能够诱导小鼠生物节律紊乱,大脑损伤,进而促使体重增重率下降[7]。Tan等[10]发现,丙烯酰胺会引发肝细胞线粒体功能障碍,进而造成肝损伤;Erdemli等[11]研究表明长时间暴露丙烯酰胺会引起机体肾发生癌变。本研究通过对小鼠暴露不同浓度的丙烯酰胺,发现随着暴露时间的延长小鼠体重增重率逐渐下降,肝、肾系数明显降低。因此,实验结果表明高剂量丙烯酰胺(≥120 mg/kg)会导致小鼠体重增重率显著下降,中高浓度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)会对小鼠肝、肾等器官产生明显的损伤效应。

机体的生理变化和病理变化往往会导致血液成分发生改变,因此血液成分检测具有重要的临床意义[12]。动物实验表明血液中丙烯酰胺的含量大约占摄入体内的丙烯酰胺总量的12%[13]。血液对机体免疫有着极其重要的作用[14]。红细胞系统中含有许多与免疫相关的物质,能够识别、杀伤抗原,清除免疫复合物,并参与机体免疫调控的作用[15];白细胞系统中的淋巴细胞、白细胞、中性粒细胞等不同细胞间比例的变化可作为免疫细胞显微分化的评价指标[16]。Panyod等[17]发现进入血液的丙烯酰胺,会产生强烈的氧化应激反应,从而导致生物膜的破坏,白细胞系统受损,相关指标发生改变。由于丙烯酰胺与血红蛋白反应,生产血红蛋白加合物,进而导致红细胞系统受到损伤,造成各细胞指数下降[18]。实验结果表明高剂量丙烯酰胺能引起小鼠WBC、LYM轻微下降,而GRAN却明显增加,说明丙烯酰胺会导致实验小鼠出现一定的炎症。同时发现高剂量组小鼠的RBC、HGB、MCHC显著下降,说明高剂量的丙烯酰胺能引起小鼠轻度贫血。此外,血小板系统中PCT和P-LCR也下降,说明实验小鼠有骨髓造血功能下降的倾向。综上,当丙烯酰胺含量≥120 mg/kg时会导致小鼠机体产生炎症、贫血、骨髓造血功能下降等症状。

ALT、AST主要存在于肝细胞中,是肝细胞受损伤时比较灵敏的指示性指标,肝细胞受损致使转氨酶释放到血液里,血清转氨酶随之升高[19]。AKP主要来源于脊椎动物肝和骨骼中。在临床上ALT、AST和AKP是肝胆系统疾病诊断的重要指标。本实验结果表明丙烯酰胺引起小鼠血清转氨酶及AKP升高,同时肝的器官系数下降,说明中高剂量的(≥120 mg/kg)丙烯酰胺会对小鼠的肝功能造成一定的损伤。

CREA主要由磷酸肌酸水解产生,BUN是蛋白质代谢的终产物,当肾功能受到损害时,其排出CREA和BUN的能力下降,血液中CREA和BUN浓度会升高。因此,检测血液中CREA及BUN是判定肾功能是否受损的重要方法[13]。UA是机体嘌呤的最终产物,血清中的UA只有通过肾排出体外,当肾小球滤过率下降,或者肾小球UA的重吸收增加或者分泌减少时,均可导致血清UA的含量升高。本实验发现小鼠暴露丙烯酰胺染后,血清CREA、BUN、UA的含量增加,染毒剂量越高增幅越明显,且与对照组相比增加显著,因此表明中高剂量(≥90 mg/kg)的丙烯酰胺暴露可引起小鼠肾功能性损伤。

4 结论

丙烯酰胺会导致小鼠生长减缓,并对小鼠血液产生一定得毒性效应,导致机体发生炎症、贫血甚至降低造血功能。当丙烯酰胺浓度≥60 mg/kg时,小鼠血清指标会发生明显变化;中高浓度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)会对小鼠红细胞系统、白细胞系统、肝、肾等器官产生一定的损伤效应。高浓度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)会影响小鼠的体重增长,并对血小板系统造成明显的损伤。