系统性红斑狼疮脑病动物模型研究进展

王赛雯,梁军,侯亚义,窦环*

(1.南京大学生命科学学院,南京 210023;2.南京大学医学院附属鼓楼医院 风湿免疫科,南京 210008;3.南京大学医学院,南京 210093)

系统性红斑狼疮脑病(systemic lupus erythematosus encephalopathy,NPSLE)是自身免疫疾病系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)累及中枢神经系统以及周围神经系统发生弥漫性或局灶性损害的后果,患者普遍出现包括认知、记忆减退以及抑郁和焦虑样情绪异常等19种神经精神综合方面的障碍,此外,NPSLE可能为系统性红斑狼疮的首发症状,并独立于SLE活跃状态和器质性病理特征[1-4]。目前,对于SLE动物模型已有相关总结[5-6],然而,对于NPSLE动物模型的总结较为缺乏。为了研究NPSLE发病机制和评估治疗方案的应用效果,国内外学者通常选用小鼠进行疾病动物模型制备。NPSLE模型主要分为人工诱导型和自发型两种类型,本文通过总结不同类型NPSLE小鼠模型构建方法,阐明了各种模型的优势特点;基于上述NPSLE模型,评述了NPSLE疾病机理研究的新进展以及治疗策略选择的新依据,从而为探寻NPSLE发病机制、筛选治疗药物、开发个性化诊疗方案提供合适的模型参考。

1 NPSLE动物模型的评价

NPSLE最常见的神经精神(neuropsychaiatric,NP)症状显示为大脑弥漫性受累,症状包括抑郁、认知和智力缺陷、精神病和癫痫,此外局灶性神经损害也常常出现,包括运动障碍、脊髓病、四肢瘫痪、中风和神经病变(颅脑和外周)[7-8]。在NPSLE小鼠模型中,同样具有与NPSLE临床患者相符的神经精神障碍。

对于NPSLE模型的评价,通常可借助免疫组化、脑部电子计算机断层扫描、磁共振波谱成像技术等观察小鼠脑组织损伤、海马等脑区神经元的凋亡以及炎症反应程度;小鼠精神异常的评价方式则包括空间运动和探索行为评价、学习记忆评价与情绪行为评价:空间运动和探索行为可由平衡木实验[9]、阶梯实验[10]来评测;学习记忆包括记忆保持能力和认知能力,可通过Morris水迷宫[11]、T-迷宫[12]、物体识别测试[13]、Barnes迷宫测试[14-15]以及圆形平台实验[16]来评测;情绪行为包括抑郁、焦虑以及社会性心理等可通过社会剥夺实验[17]、强迫游泳实验[18]、社会偏好测试[19]以及高架十字迷宫测试[20]来评测;值得注意的是,旷场实验[9,21]既可用于空间运动和探索行为评价也可用于情绪行为评价。

2 NPSLE动物模型的分类及特征

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.1 人工诱导型NPSLE小鼠模型

人工诱导型小鼠NPSLE模型采用自身抗体、抗原或降植烷(Pristane)、咪喹莫特(imiquimod,IMQ)等生物试剂在小鼠体内注射进行诱导。总体来看,人工诱导型的NPSLE模型小鼠的NP特点通常会表现为记忆认知能力的减退。

2.1.1 自身抗体

研究表明,渗透到大脑中的自身反应性抗体,会诱导神经元死亡与小胶质细胞活化,伴随着中枢神经系统炎症和脑缺血乃至脑室周围区域的神经变性、脑组织损伤,并最终导致精神病或癫痫等NPSLE症状[22-24]。因此,可以直接通过侧脑室局部注射自身抗体的方法诱导NPSLE。由于脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)注射后可刺激星形胶质细胞-VEGF-A通路,诱导血脑屏障的破坏及功能改变[25-26],研究人员还可采用LPS外周诱导协同静脉注射自身抗体的方法建立NPSLE小鼠模型。以下总结自身抗体诱导NPSLE模型的NP特点。

(1)自身抗体侧脑室局部诱导:抗DNA抗体、抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase,GAPDH)单抗、抗ATP单抗等均被证明可作为NPSLE的抗体标志物,可用于诱导建立NPSLE动物模型,模型小鼠NP特点主要为记忆、认知损伤。DNA16/6-ID抗体为带有16/6-ID(IgG1/k)的人源单克隆抗体[27],Kivity等[28]利用抗DNA16/6-ID抗体对C3H小鼠进行右侧侧脑室注射,实验结果发现抗16/6-ID抗体脑内注射的小鼠表现出选择性认知障碍,即视觉识别和空间记忆障碍。此外,Berry等[29]与Delunardo等[13]分别利用3~4个月龄雄性/雌性C57BL6成年小鼠在立体定向仪上[30]向右侧脑室注射抗ATP单抗/抗GAPDH单抗。行为学分析结果表明:抗ATP抗体与抗GAPDH抗体分别处理小鼠后,均出现记忆与认知损伤,而抗GAPDH抗体还可诱导小鼠出现孤僻静止、高警觉等情绪特征相关的行为改变。

(2)自身抗体协同LPS外周诱导:抗核糖体P蛋白抗体(抗P抗体)可作用于神经元表面P抗原(neuronal surface P antigen,NSPA),抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl D-aspartate receptor,NMDAR)抗体可与神经元的NMDAR结合,以上两种抗体均介导神经损伤通路[31-32]。研究证实抗P抗体与NMDAR抗体诱导的NPSLE小鼠模型均表现出依赖于海马的灵活记忆受损。Bravo等[33]、Kowal等[34]选用6~8周龄BALB/c雌性小鼠静脉注射抗P抗体/抗NMDAR抗体IgG,且在抗体注射后间隔48 h两次腹腔注射LPS,剂量为3 mg/kg。水迷宫与一系列学习任务[35]测试表明,抗P抗体与IgG抗体协同LPS诱导NPSLE模型小鼠均出现柔性记忆缺陷,具体表现为海马依赖的灵活记忆受损和学习能力减退。

2.1.2 自身抗原

注射自身抗原目的往往是诱导相应自身抗体的生成,多采用弗氏佐剂包括完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)与不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s adjuvant,IFA),以MAP(Multiple-Antigen Peptide,MAP)肽与DWEYS两种形式来交联抗原。MAP为多聚抗原肽,能够产生高滴度、高亲和力抗体;DWEYS为8分支MAP交联肽,常用于与抗NMDAR抗体相应的抗原交联,在研究NMDAR对NPSLE的致病机制上有相关报道[36]。目前,均采用自身抗原协同LPS的诱导方式来构建NPSLE小鼠模型。

研究证实,神经元中间丝蛋白(intermediate neuro filament alpha-internexin,INA)、NMDAR抗原以及抗磷脂抗体相关抗原β2糖蛋白(β2 Glycoprotein-I,β2-GPI)均可诱导NPSLE小鼠模型,自身抗原协同LPS方式构建模型的NP特点共同之处在于都具有空间记忆、认知障碍。Lu等[37]与Kowal等[35]别选用6~8周龄雌性C57BL/6小鼠与雌性BALB/c小鼠腹腔注射交联INa/NMDAR抗原的MAP肽,第一次免疫使用CFA后每两周1次使用IFA增强免疫效果,随后用LPS处理。在LPS处理后1~2周进行组织学、认知和行为学检查。行为学检测(水迷宫、T-迷宫任务、旷场实验和平衡木实验)中,Ina+LPS与NMDAR抗原+LPS处理的NPSLE小鼠的均出现明显地语言和空间方面的学习记忆缺陷,此外,Ina+LPS处理的小鼠模型还表现出探索和运动协调障碍。β2-GPI也称为载脂蛋白H,是抗磷脂抗体结合主要辅助因子[38],可作为自身抗原成分诱导体内抗磷脂抗体的生成[39],Shrot等[40]使用3月龄雌性BALB/c小鼠,后足皮下注射CFA乳化的β2-GPI构建NPSLE模型小鼠。行为学评估(阶梯试验、T迷宫)结果表明,β2-GPI免疫的小鼠NP特征为过度活动、焦虑及导航与工作记忆能力减退,且过度活动可作为该模型鼠的典型甄选指标。

2.1.3 Pristane

Pristane能够在小鼠体内诱导广泛的SLE特异性自身抗体如抗dsDNA、抗Sm、抗RNP和IgG等[41-43],因此,Pristane是作为诱导SLE动物模型的常见手段。已有研究发现Pristane诱导的小鼠模型同样也具有NPSLE症状。Luciano等[15]对8~12周龄雌性BALB/c小鼠,利用腹腔注射pristane或pristane协同LPS诱导的方式构建小鼠模型,分别在7周与12周进行组织学与行为学检测,观察到Pristane/Pristine+LPS处理的小鼠除了产生大量的抗Sm抗体、蛋白尿等典型的SLE疾病表现外,在小鼠海马组织中均发现与学习和记忆障碍相关NR2A(NMDAR的多肽链)亚单位表达下调,同时,Bames迷宫测试显示7周龄的两组小鼠均出现短期记忆下降,且Pristane+LPS组相较于Pristane组的短期记忆下降更为明显并可维持到12周。可见,Pristane或Pristane协同LPS处理方式均可作为构建NPSLE动物模型方法,且Pristane协同LPS处理方式为更优选择。

2.1.4 IMQ

Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)激动剂咪喹莫特IMQ已被用于许多狼疮研究[44-45]。最新的研究发现IMQ还可诱导NPSLE小鼠模型,主要表现为认知障碍。Qiao等[46]利用9周龄C57BL/6雌性小鼠,涂抹5%IMQ乳膏(每只1.25 mg)于小鼠右耳背部皮肤,每3 d给药1次,连续给药8周,即可建立SLE动物模型。研究人员发现IMQ诱导的狼疮小鼠S100β水平显著升高、NSE水平显著降低伴有中枢神经系统紊乱,组织学观察显示大脑皮层和海马DG区的神经元萎缩、核染色质凝聚;行为学(MWM测验和恐惧条件反射测验)研究发现其模型小鼠空间学习记忆能力减弱。此外,IMQ模型小鼠海马区Epdr1、Gm5900和Enpp2基因的表达与AD疾病特征一致。上述结果表明,IMQ诱导的狼疮小鼠存在NPSLE认知功能障碍。

2.2 自发型NPSLE小鼠模型

基因突变型狼疮小鼠具有先天性发病的特点,主要种类包括MRL/MpJ-Faslpr(MRL/lpr)、BxSB、NZB×NZW F1(NZB/W F1)三种,小鼠的NP症状表现也各有不同,发病时间早晚不一,且具有性别偏好性。BxSB和NZB/W F1小鼠的脑结构出现缺陷和神经退化明显[47-48],MRL/lpr小鼠的NPSLE研究中证实,自身免疫疾病本身也会作用于中枢神经系统,从而导致MRL/lpr小鼠神经退行性变化[49]。

2.2.1 MRL/lpr小鼠

MRL/lpr小鼠由Lg/J、C3H/Di、C57BL/6和AKR/J等几个小鼠品系杂交而成[50],其与BxSB不同,雌鼠发病时间明显早于雄鼠,并产生针对dsDNA和Sm的自身抗体[51-52]。MRL/lpr小鼠的NP症状有早期抑郁和快感等强化系统减弱,冷漠和独处、缺乏活动并伴有一定的空间学习障碍[53]。MRL/lpr小鼠在早期(8周龄)即表现出明显的抑郁情绪,即缺乏好奇心、对新事物冷漠[54]等典型NP特征;至10周龄时,MRL/lpr小鼠即出现以视觉空间记忆障碍为特征的认知缺陷[55]。

MRL/lpr小鼠的NP症状多数是由自身免疫疾病所引发。MRL/lpr雌性小鼠在8周后可检测到明显自身免疫相关的自身抗体(如抗dsDNA、NMDAR抗体),并随周龄增加而增加[54]。此品系小鼠NPSLE发病的原因一方面可能与其自身免疫激活有关,通过慢性炎性疼痛或促炎神经肽对脑功能产生影响,另一方面可能与中枢神经系统结构性改变有关,包括中脑边缘多巴胺能通路损坏、边缘系统的炎症反应与脑萎缩或海马、皮质脑区神经元活动出现改变等,最终影响情绪或认知[54,56-57]。此外,白细胞浸润引发的脑生长迟缓、脑功能异常也被证实为是MRL/lpr小鼠出现神经变性的诱因[58]。

2.2.2 BxSB小鼠

BxSB小鼠,又称为MP(BxSB/YAA)小鼠,是(B6×Sb/Le)F1到Sb/Le回交的重组近交系小鼠[59]。BxSB小鼠出现NPSLE症状具有年龄递进性以及性别特异性,高龄雄性BxSB小鼠的NP特征表现为运动技能以及空间学习能力减退。研究表明,26周龄BxSB雄性小鼠的空间学习能力退化,且脑组织中呼吸链末端的CO复合体酶活性下降、数量减少;此外,随着年龄的增长,血清中抗核抗体水平明显升高,空间学习能力与血清对自身核抗原的反应性之间存在显著的相关性。而上述现象均未在6周龄、26周龄雌性以及6周龄雄性BxSB小鼠出现[60]。

病因研究发现,4月龄BxSB雄性小鼠在靠近脑室的大脑区域、血管周围区域和海马体颗粒细胞中均存在高水平的免疫球蛋白和炎症反应;而在1月龄的BxSB雄性小鼠脑中并没有发现上述现象[61]。BxSB雄性小鼠的大部分NP症状与衰老症状相似,因此,BxSB小鼠也可以作为研究病理性衰老的模型动物。

2.2.3 NZB/WF1小鼠

NZB/WF1小鼠是新西兰黑(NZB)和新西兰白(NZW)两品系杂交获得,由于MCH基因之间复杂的基因突变和相互作用,小鼠体内产生大量自身抗体和免疫复合物沉积,最终进展为严重自身免疫性疾病[62]。研究表明,NZB/WF1雌性小鼠在31周龄时,出现较严重的肾炎、肾损伤以及高滴度的血清抗dsDNA和IgG等,这些都是SLE病理损伤的表现[63]。至10~18月龄时,该品系小鼠会产生学习记忆缺陷、平衡运动能力减弱等异常的NP症状,且中枢神经系统功能障碍的发生频率、严重程度与年龄呈正相关。此外,大脑、海马血管和脉络丛单核细胞浸润,以及皮层、海马和下丘脑中神经肽水平降低等现象也常常出现,这也可能是产生NP症状的诱因[64-65]。因此,NZB/WF1小鼠也适用于狼疮脑病相关研究,然而,由于NP特征出现较晚,相关研究进展有限。NPSLE动物模型的分类及特性的关键信息详见表1。

表1 NPSLE小鼠模型Figure 1 Mouse models of NPSLE

3 NPSLE动物模型的应用

3.1 NPSLE的致病机制研究

研究发现,多种自身抗体与自身抗原,包括针对核酸、核糖体P蛋白的自身抗体、NMDAR抗体、GAPDH以及膜成分如磷脂与糖蛋白抗体等以及自身抗原INa,被证实与NPSLE有关——自身抗体(抗原)可通过多种方式引起海马等脑区的神经元凋亡,造成脑组织损伤,进而诱发小鼠产生认知功能障碍、记忆障碍和情绪变化等NP症状,具体机制如下所述。

Bravo等[33]利用抗P抗体诱导的NPSLE小鼠模型实验证实,抗P蛋白与海马神经元表面表达的NSPA结合可以诱导神经元胞浆钙水平增加,进而引发神经元凋亡。此外,抗P抗体还可以通过抑制蛋白质合成的方式导致功能性细胞损伤和细胞凋亡[68-69]。Kowal等[34-35]利用NMDAR抗体IgG诱导的NPSLE小鼠模型发现,抗NMDAR抗体可介导caspase-3等NMDAR下游通路激活,引发海马CA1免疫球蛋白沉积、炎症浸润与神经元凋亡。除IgG外,NMDAR相关抗体IgA、IgM也会诱导神经元突触减少以及脑炎[70]。同时,Lu等[37]与Berry等[29]分别利用自身抗原/自身抗体构建的NPSLE小鼠模型证实:INa与抗ATP抗体均可以在小鼠体内诱发脑神经元凋亡,其中抗INA抗体是通过抑制轴突生长和轴突延长的方式诱发细胞凋亡,而抗ATP抗体作用下小鼠脑组织细胞骨架肌动蛋白成分发生改变,这可能是由于酸性应激下脑内产生大量自由基使得细胞凋亡。此外,Delunardo等[13]利用GAPDH单抗诱发NPSLE小鼠模型,发现抗GAPDH单抗诱导了神经突起的回缩,具体机制为:抗GAPDH单抗可以阻断GAPDH分子与中枢神经系统中层粘连蛋白与其他黏附和突触分子的结合,从而改变神经元的可塑性,进而使得神经功能受损[71-72]。,

3.2 NPSLE治疗策略的评价

最近,研究人员发现了若干NPSLE的特异性靶点,通过抑制其表达或阻断其功能可以减轻NPSLE症状。利用自发型狼疮脑病小鼠或自身抗体诱导的NPSLE小鼠模型,两种神经受体抑制剂NMDAR拮抗剂 Memantine[35]和鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)受体抑制剂FTY720(Fingolimod)[73-74]均可通过口服或腹腔注射的给药方式缓解NPSLE症状、阻断疾病发展。此外,敲除NPSLE相关基因,如雌激素受体α(Estrogen Receptorα,ERα)[75]、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白Lipocalin2(Lcn2)[76]等,也被证实可有效阻断NPSLE的疾病进展。

研究者发现,雌激素受体α基因敲除后有效限制了NPSLE的疾病进展。Cunningham等[75]将C57BL/6品系的ERα基因敲除(ERαKO)小鼠与MRL/lpr小鼠进行回交所得MRL/lpr小鼠模型,选取雌性ERα+/+或ERαKO型小鼠幼龄状态进行实验,通过对小鼠的行为学与脑组织炎症情况的分析,发现缺乏功能性ERα的小鼠情绪控制及学习记忆能力明显增强;海马CA1区和齿状回的小胶质细胞炎症反应明显减少,并认知障碍的进展减缓,证实了ERα是狼疮易感雌性小鼠的关键介质,在免疫细胞的激活或发育中起关键作用,这对于狼疮脑病的治疗具有一定的应用前景。

Lipocalin 2(Lcn2)也可作为NPSLE的治疗靶点。Mike等[76]证实Lcn2是神经精神性狼疮的致病决定因素和生物标志物。B6.Sle1/Sle3(Sle1,3)小鼠是由NZM2410自发性SLE模型中的两个狼疮易感基因位点导入非自身免疫性C57BL6小鼠而形成的双基因品系[77],研究人员将Sle1,3品系小鼠建立为NPSLE模型,Sle1,3小鼠表现出抑郁样行为,空间能力和再认记忆受损,这些缺陷在Sle1,3-LCN2KO小鼠中得到缓解。这证明Lcn2是NPSLE中有害神经免疫反应的主要调节因子,缺乏Lcn2可有效减弱免疫炎症反应以及脑部的NPSLE症状。

FTY720作为S1P受体抑制剂可发挥免疫调节作用[78],具有抑制淋巴细胞进入中枢神经系统的作用[79]。MRL/lpr小鼠研究表明,FTY720可有效治疗NPSLE。研究人员通过每周3次,连续12周对B6.MRL/lpr小鼠口服灌胃FTY720(2 mg/kg),发现FTY720给药处理B6.MRL/lpr小鼠后,皮层、海马和杏仁核中的神经元损伤都有所减轻。旷场实验、尾部悬挂测试结果也证实模型小鼠的抑郁样情绪症状得到改善[73]。此外,Mike等[74]通过腹腔注射FTY720(3 mg/kg)的方式处理10周龄MRL/lpr小鼠,每周3次,连续4周。实验结果同样证实FTY720对NPSLE具有治疗效果,但值得注意的是,尽管FTY720对NP症状有所改善,但大脑皮层和海马区的细胞因子水平并没有明显降低。由此可推测,FTY720是通过一种不依赖于自身抗体或细胞因子减少的机制来减轻NPSLE,同时,S1P通路可作为NPSLE治疗的新靶点。

此外,研究人员还利用MAP-peptide诱导小鼠体内产生抗DNA抗体,不仅研究了抗NR2/DNA抗体的致病机制,同时还证实了NMDAR拮抗剂(Memantine)的神经症状缓解作用。Memantine的给药方式为:在LPS注射前30 min或注射后24 h后进行,在林格氏液中以5 mg/kg的剂量注射。通过fluoro-jade和对caspase进行染色,观察神经元损伤的变化,发现阻断NMDAR受体可一定程度减少海马神经元凋亡,避免海马神经元损伤[35]。这些实验结果提示,阻断自身抗体作用位点,可以减弱由于自身抗体引发的脑组织损伤与神经异常。

上述研究提示,阻断特定神经受体或者敲除NPSLE发病基因或许可以减弱NPSLE引发的脑组织损伤与神经异常现象,从而逆转NPSLE的发病进程,这有可能作为潜在的NPSLE治疗途径。

4 总结及展望

本文对NPSLE动物模型的分类及特征进行了总结,结合国内外研究,对NPSLE动物模型的应用进行整理。目前,MRL/lpr与NZB/W F1自发型小鼠模型是评估NPSLE治疗效果的优选模型。然而,BxSB自发型NPSLE小鼠模型由于其发病周期较长,相关NP特征描述与应用研究较为匮乏,有待更多的研究成果予以支撑和验证。值得注意的是,自身抗原(抗体)诱导NPSLE动物模型在神经免疫互作诱发NPSLE的致病机制研究中做出了重要贡献。此外,本文提供了一些治疗NPSLE的新靶点,包括雌激素受体α、Lcn2以及SIP受体、NMDA受体,可为NPSLE药物研发与治疗提供新策略。