调血脂类中药及中药单体对羧酸酯酶1体外活性抑制作用研究△

王汇滨，许汉卿，马佳睿，张昕彤，贺智承，于青，邹立伟，刘东春*

1.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；

2.沈阳北创医学检验所有限公司，辽宁 沈阳 110000；

3.沈阳药科大学 制药工程学院，辽宁 沈阳 110016；

4.沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016；

5.上海中医药大学 交叉科学研究院，上海 201203

人羧酸酯酶（carboxylesterases，hCE）属丝氨酸水解酶家族，作为人体内一类重要的代谢酶，广泛分布于多种组织细胞的内质网中[1]。hCE1 和hCE2 是其中2种主要的水解酶，hCE催化各种内源性和外源性硫酯类、碳酸酯类和酰胺类化学物质的水解[2-3]。hCE1 和hCE2 具有47%的氨基酸序列同一性，但这2 种酶表现出不同的组织分布及不同的底物和抑制剂特异性[4-5]。hCE1 和hCE2 在肝脏中均存在，但以hCE1 为主[6]，而人体小肠部位的羧酸酯酶主要是hCE2[7]。

有研究表明，hCE1 在调节脂肪酸分布和控制肝脏脂质生物合成、分泌与分布中发挥作用[8-9]。体内高水平的葡萄糖也会诱导hCE1活力升高，促进脂肪合成[6]。近期有文献报道，hCE1 可能在肥胖相关的心血管危险因素中起作用，并有望成为代谢综合征的治疗靶点[10]。hCE1 的活性在肥胖症和2 型糖尿病患者的脂肪组织中升高，而用hCE1抑制剂治疗将为脂质代谢、糖代谢异常带来多重有益作用。因此，hCE1已经成为治疗高脂血症的重要靶点[11-12]。

在药物代谢方面，hCE1 为丝氨酸水解酶家族的药物代谢I 相酶，hCE1 调节剂可通过调节酯类药物的水解速度而调节药物的代谢速度及活性[13]。hCE1介导多种药物水解过程，如洛伐他汀、非诺贝特、氯吡格雷等[2]。日常食物及中药中存在影响hCE1 活性的物质，从而影响药物的效力，可能导致疗效降低或者药物中毒[14-15]。本研究根据文献报道[16-19]选取了部分具有调血脂活性的中药材及中药单体，考察其对hCE1 活性的影响，研究其调血脂作用与hCE1活性抑制作用的关系，为调脂类药物的开发和药物安全有效应用提供依据。

1 材料

1.1 试药

决明子Cassiae Semen、绿茶Green Tea、胡椒Piperis Fructus、女贞子Ligustri Lucidi Fructus、干姜Zingiberis Rhizoma、栀子Gardeniae Fructus、柴胡Bupleuri Radix、山楂Crataegi Fructus、制何首乌Polygoni Multiflori Radix Praeparata、蒲 黄Typhae Pollen、红花Carthami Flos、虎杖Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix、泽泻Alismatis Rhizoma、地龙Pheretima、茵陈Artemisiae Scopariae Herba、玉竹Polygonati Odorati Rhizoma、荷叶Nelumbinis Folium、枳壳Aurantii Fructus 药材购于沈阳成大方圆药店，经沈阳药科大学生药教研室刘东春副教授鉴定均为正品。

甘草次酸（批号：PB171125-3）、槲皮素（批号：PB171221-6）、木犀草素（批号：PB171205-3）、水飞蓟素（批号：PB171015-3）、灯盏花素（批号：PB180105-3）、黄芩素（批号：PB170821-9）、二氢杨梅素（批号：PB180305-1）、熊去氧胆酸（批号：PB170915-7）、苦参碱（批号：PB180305-5）、氧化苦参碱（批号：PB170921-4）、京尼平（批号：PB180315-1）、栀子苷（批号：PB170925-7）购于陕西帕尼尔生物科技有限公司，纯度均大于98%。

无水乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、磷酸二氢钾（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，分析纯，国药集团试剂有限公司）；D-荧光素甲基醚（DME，上海中医药大学系统药代动力学中心）；Promega 双荧光素酶报告基因（DLR）检测试剂盒[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]；人肝微粒体酶[HLM，瑞德肝脏疾病研究所（上海）有限公司]。

1.2 仪器

SQP QUINTIX125D-1CN 型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；SCIENTZ-12N 型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MIX-3000型金属孵育器（杭州米欧仪器有限公司）；SpectraMax iD3型酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 药材提取与供试品溶液的配制

取药材3 g，用70%的乙醇50 mL 浸取24 h 后，50 ℃超声波提取1 h，滤过，残渣用70%乙醇30 mL再超声提取30 min，滤过，合并滤液。滤液在旋转蒸发仪中减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水适量使总体积为20 mL，超声混悬均匀，用乙酸乙酯50 mL分2 次萃取，合并萃取液。减压旋蒸除去乙酸乙酯至干，取少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯提取物转移至西林瓶中，冷冻干燥后，作为酯层供试品。萃取后剩余水层用旋转蒸发仪浓缩至适宜体积，转移至西林瓶，冷冻干燥，作为水层供试品。

精密称量上述酯层和水层冻干粉末、供试单体化合物约2.0 mg，用50% DMSO 水溶液溶解，配制成质量浓度为1.0 mg·mL-1供试品溶液，待用。

2.2 DME探针检测hCE1活性原理及操作步骤

DME 探针检测hCE1 活性原理见图1[20]。DME 探针经hCE1水解后为生成萤火虫荧光素酶的底物，可基于单位时间产物的相对光单位（RLU）值确定hCE1 的活性。为确保反应速率在线性范围内，所使用的孵育时间、HLM质量浓度及探针浓度根据文献及预实验结果确定。评估样品对hCE1活力影响的体外孵化系统（总体积100 μL）包含HLM（200 μg·mL-1，终质量浓度为10 μg·mL-1）5 μL、磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol·mL-1，pH 6.5）91 μL、DME（150 μmol·L-1，终浓度为3 μmol·L-1）及1.0 mg·mL-1的供试品溶液（终质量浓度为20 μg·mL-1）2 μL。

图1 DME化学发光探针法检测hCE1活性机制

取HLM、PBS和供试样品溶液加入离心管后在涡旋仪上振荡混匀，离心管置于37 ℃金属浴振荡预孵10 min，加入DME 溶液2 μL，继续振荡孵育10 min后，取反应液50 μL加入装有LDR 50 μL的白色不透明标准96 孔板。同时设置相关对照组，空白对照组不加入酶液，用等体积PBS 溶液代替，作为本底荧光；阴性对照组不加入供试样品，用等体积50%DMSO 水溶液代替，作为酶活性100%对照。随后采用全自动荧光酶标仪进行化学发光分析，利用动力学方法检测。检测30 min 后取出96 孔板。每个样品设置3个复孔。

2.3 hCE1酶活力的计算

通过测定探针底物代谢产物的RLU 值来确定酶活力（Eres）。由公式（1）计算药物作用下的Eres。

式中，C0为空白对照组孵育反应后代谢产物RLU 生成量，C1为阴性对照组孵育反应后代谢产物RLU 生成量，Ci为给药组孵育反应后代谢产物RLU生成量。

采用GraphPad Prism version 8.0.2 软件拟合Eres，测定20 min 时酶活力趋于稳定，对该时间点RLU 值进行分析处理，数据以（±s）表示。选取hCE1 酶活力在20%以下的药材或单体，稀释后进一步考察终质量浓度为2 μg·mL-1时对hCE1的抑制效果。

3 结果

3.1 中药提取物对人肝微粒体hCE1酶活力的影响

提取物质量浓度为20 μg·mL-1时，hCE1 的酶活力＜20%的有绿茶酯层、女贞子水层、干姜酯层、胡椒水层、决明子水层、红花酯层、决明子酯层、柴胡水层、制何首乌水层、胡椒酯层、蒲黄酯层。对酶活力＜20%的样品稀释10 倍后测定，结果表明，当质量浓度为2 μg·mL-1时，其中绿茶酯层、蒲黄酯层、决明子水层hCE1 酶活力分别为19.34%、29.99%和30.41%，即使在低质量浓度下也表现出较好的hCE1抑制作用（表1）。

表1 18种中药提取物体外对hCE1活力的影响（±s,n=3）

表1 18种中药提取物体外对hCE1活力的影响（±s,n=3）

3.2 中药来源活性单体对hCE1酶活力的影响

单体质量浓度为20 μg·mL-1时，hCE 酶活性＜20%的有甘草次酸。进一步稀释后，其质量浓度为2 μg·mL-1时hCE1酶活力为31.24%（表2）。

表2 12个中药来源活性单体不同质量浓度下体外对hCE1酶活力的影响（±s,n=3）

表2 12个中药来源活性单体不同质量浓度下体外对hCE1酶活力的影响（±s,n=3）

4 讨论与结论

研究发现，绿茶酯层、女贞子水层、干姜酯层、甘草次酸、胡椒水层、决明子水层、红花酯层、决明子酯层、柴胡水层、制何首乌水层、胡椒酯层、蒲黄酯层等对hCE1 抑制效果较好。绿茶中的茶多酚、女贞子中的三萜类、干姜中的多酚类、胡椒中的胡椒碱、决明子中的蒽醌类、红花中的黄酮类、柴胡中的三萜皂苷类、首乌中的蒽醌类和二苯乙烯类、蒲黄中的黄酮类可能是抑制hCE1活性的主要成分，进而发挥其调血脂作用[15]。活性单体实验结果表明，甘草次酸显示出较强的活性。甘草次酸属五环三萜类化合物，是甘草的主要有效成分，相关研究通过构效关系分析表明，三萜类化合物广泛存在hCE1 抑制活性，并可进一步通过结构修饰成为高选择性和高效的hCE1 抑制剂[21]。本研究中其他单体的活性并不显著，这也说明中药对hCE1的抑制作用较复杂，还需要进一步深入研究。

本研究考察了18个调血脂类中药及12个中药单体在体外对hCE1 活性的抑制作用。绿茶、女贞子、干姜、甘草、胡椒、决明子、红花、柴胡、制何首乌、蒲黄中的化学成分对hCE1 有较强的抑制作用。需要注意的是，服用这些药物或食物时（如饮茶），除了调血脂外，其羧酸酯酶抑制作用会影响hCE1参与代谢的药物的血药浓度及药效，如洛伐他汀、非诺贝特、氯吡格雷等[2,13]。