铜离子对中华绒螯蟹幼蟹的急性致死效应及组织显微结构的影响

童帅旗，付龙龙，蒋琦辰，苗珍，张晓君*，潘建林

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州225009；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京210017）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹、大闸蟹等，属于节肢动物门，甲壳纲，十足目，方蟹科，绒螯蟹属[1]。中华绒螯蟹的养殖在我国水产业中有着十分重要的地位，每年为养殖户创造了可观的收益[2]。然而由于部分养殖户用药的不规范，导致环境问题日益突出，向环境中排放的污染物也逐年增多[3]。

铜是机体生长发育过程中所必需的微量元素，是甲壳类合成血蓝蛋白所必需的营养元素之一，在细胞活动中也扮演着重要的角色[4]，但是高浓度的铜会对机体产生毒性效应[5]，并且由于铜参与机体的生命活动，更易被吸收，导致在体内大量积累[6]。由于铜离子（Cu2+）具有良好的灭藻及杀灭部分寄生虫的效果，广泛用于水体消毒[7]。铜是我国养殖水域中超标最严重的重金属之一[8]。因此，现以中华绒螯蟹幼蟹为研究对象，研究了Cu2+对其急性致死效应，以及不同浓度Cu2+对其组织显微结构的影响，为进一步评价Cu2+在水产养殖中的危害提供了理论基础。

1 材料方法

1.1 试验材料

试验用中华绒螯蟹取自江苏省淡水水产研究所浦口基地，挑选附肢完好、体表无损伤、活力强、大小均匀且平均体质量为（29.24±4.42）g的中华绒螯蟹为试验对象。中华绒螯蟹从养殖池塘取回后，于玻璃水族箱（80 cm×50 cm×50 cm）中驯化两周，水温为21℃，溶解氧质量浓度为5 mg/L，光暗比为12 h∶12 h，每天早晚投喂中华绒螯蟹专用饲料。试验前1 d将中华绒螯蟹移入试验用塑料箱（60 cm×40 cm×25 cm）中，并停止投喂。试验用Cu2+是由五水硫酸铜（CuSO4·5H2O2）分析纯溶解而成，用19.53 g CuSO4·5H2O2溶解于1 L纯水中，制备为5 g/L的Cu2+母液。试验用水均为提前曝气24 h以上的自来水。

1.2 Cu2+对中华绒螯蟹幼蟹LC50的测定

文献［9-11］中Cu2+对中华绒螯蟹的半致死浓度设计预试验，根据预试验得出的最大全存活浓度和最低全致死浓度设计半致死浓度测定试验。设Cu2+质量浓度为0.5，1.0，2.0和4.0 mg/L的4个试验组进行半致死浓度测定[12]，试验前一天停止投喂，每天各试验组全部换水，并及时补充Cu2+。

1.3 Cu2+胁迫后肝胰腺及鳃组织病理变化

急性毒性试验组共四组，其Cu2+质量浓度分别为0，0.1，0.2和0.4 mg/L，每组3个平行，每个平行10只中华绒螯蟹，试验前一天停止投喂，每天各组全部换水。于24，48和96 h各试验组取6只中华绒螯蟹在冰上处死，取其肝胰腺和鳃组织并用Bouin’s液固定。然后送样至武汉塞维尔生物科技有限公司，进行石蜡包埋切片。

2 结果

2.1 半致死浓度

根据中华绒螯蟹幼蟹各时间段的死亡率计算半致死浓度[13]。死亡率及96 h LC50见表1、表2和表3。

表1 Cu2+对中华绒螯蟹幼蟹24～96 h死亡率%

表2 Cu2+对中华绒螯蟹幼蟹24～96 h LC50

表3 96 h LC50置信区间（a对数底=10）

2.2 Cu2+胁迫后肝胰腺组织切片观察

研究显示，随着ρ（Cu2+）的升高，中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺组织的病理变化越明显，见图1（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L处理组表现为肝小管变窄，细胞中出现空泡；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L处理组表现为基膜变薄，肝小管变粗，细胞中空泡进一步增多增大；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L处理组表现为基膜与肝小管单层柱状上皮直接形成空腔，单层柱状细胞不规则肿大，细胞中普遍出现大量空泡，肝小管中甚至出现细胞碎片。

2.3 Cu2+胁迫后鳃组织切片观察

研究显示，随着ρ（Cu2+）的升高，中华绒螯蟹幼蟹鳃组织的病理变化就越明显，见图2（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L处理组表现为鳃叶不规则增厚，鳃丝血腔增大；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L处理组表现为鳃叶不规则增厚，上皮层损伤，角质膜隆起，细胞核聚集增多；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L处理组表现为鳃叶不规则增厚，上皮层严重损伤，甚至解体。

图1不同Cu2+浓度胁迫下中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺变化

图2不同Cu2+浓度胁迫下中华绒螯蟹幼蟹鳃变化

3 讨论

陈细香等[14]研究指出，Cu2+对于克氏原螯虾的96 h LC50为5.28 mg/L，比该研究中得出的中华绒螯蟹幼蟹96 h LC50高出许多，表明克氏原螯虾对于重金属铜的耐受能力更强。黄鹤忠等[15]研究指出Cu2+对于中华绒螯蟹大眼幼体的96 h LC50为1.50 mg/L，与本研究结果相近，说明中华绒螯蟹大眼幼体与幼蟹对于重金属铜有着相近的耐受力。赵云龙等[16]研究指出，Cu2+对于花鳅的96 h LC50为0.298 mg/L，远低于本研究中的中华绒螯蟹幼蟹96 h LC50，说明花鳅对于重金属铜的耐受性相对较低，Cu2+污染可能对其会造成更为严重的危害。Oliva等[17]研究指出，Cu2+对于云斑厚纹蟹的96 h LC50为0.50 mg/L，远低于本研究中中华绒螯蟹幼蟹96 h LC50，说明中华绒螯蟹幼蟹的重金属铜耐受性较强。Yang等[11]研究指出Cu2+胁迫中华绒螯蟹会使其肾小管壁增厚、上皮细胞变性分离、基底膜与单层柱状上皮之间形成大空泡、小管腔内可见大量碎片，与本研究结果相似。Na等[18]研究发现，罗氏沼虾暴露在0.01～0.40 mg/L Cu2+中，会导致其鳃小片肿胀融合、鳃尖异常、鳃内小片增生坏死，肝胰腺可见血细胞增多、基底板增厚、肝小管坏死，与本研究结果相似，说明Cu2+对甲壳类鳃和肝胰腺危害严重。王涛等[19]的研究指出，暗纹东方鲀暴露在0.1和0.2 mg/L（96 h LC50）Cu2+浓度中，会导致其肝脏血细胞沉积以及血窦扩张、鳃上皮细胞增生产生动脉瘤，说明Cu2+对于暗纹东方鲀的毒性要高于中华绒螯蟹幼蟹。

铜虽然是甲壳类生长发育所必需的微量元素，但过量的摄入还是会对其造成严重的病理损伤。该研究发现其对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺及鳃组织的损伤十分严重，可造成形态变化及功能障碍，对中华绒螯蟹幼蟹正常生长发育有着严重的危害。