三氯生对蚤状溞急性毒性效应影响

廉洁，吴宇翔，阮凤娇，徐国成，陆正和*，蒋琦辰

（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港222005；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京210017）

三氯生（triclosan），又名三氯新，为羟二乙醚的三氯化衍生物，具有抗菌和消毒作用，广泛作为个人护理品（牙膏、肥皂、洗液等）和医用物品（医用防腐剂、杀菌剂等）的添加剂。近年来，相关研究表明，三氯生具有环境内分泌特性，对动物的生殖具有干扰作用，且在一定条件下可转化为致癌和致畸物质，其对人类和动物的健康危害已成为研究热点[1]。

水域生态系统为三氯生的主要污染区域之一，有关三氯生对水生动物的毒性影响主要集中在原生动物、浮游动物和鱼类等方面。蚤状溞是作为生态毒理学常用的浮游动物，有关三氯生对蚤状溞的毒性影响尚未见报道[2-4]。现以水体中常见的蚤状溞为受试动物，研究了三氯生对蚤状溞的急性致死效应及抗氧化酶等指标影响，获取蚤状溞对三氯生敏感性指标，为利用蚤状溞评价三氯生的毒性作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验所用的蚤状溞（Daphnia pulex）采自江苏海洋大学校园池塘，获得大量幼体后，进行扩大培养。培养使用EPA培养液[5]，饵料使用小球藻（Chlorellasp.），密度为1.0×109cells/L，培养过程中每天换水1次，培养密度为500 mL的培养液中放入30～40个1日龄幼溞，培养温度为（20±1）℃，光暗比为12 h∶12 h，光强度为18μEm-2。取单个蚤状溞（F0）进行单克隆，将其所繁殖的第一批及第二批幼体挑出弃掉，当第三批幼体出生时，弃掉母体（F0），以第三批的蚤状溞为试验母体（F1），将F1所繁殖的第一批和第二批幼体都弃掉，从第三批开始，按试验要求，在光照培养箱中进行培养。

1.2 试验试剂

试验药物三氯生（纯度99.90%）购于日本巴斯夫公司，用丙酮作为助溶剂，配成20.0 mg/L的母液，后稀释为试验测试液。超氧化歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力、谷胱甘肽转移酶（GST）活力和丙二醛（MDA）含量测定试剂盒、牛血清蛋白等试剂购于南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性试验

在预试验的基础上，获得三氯生对蚤状溞致死最低和最高质量浓度，设置三氯生质量浓度为100，200，400，800和1 200μg/L 5个试验组，同时设置空白对照组。分别向盛有40 mL测试液的50 mL烧杯内加入不小于1日龄的幼溞10只，温度为（20±1）℃，以上过程于黑暗条件下进行。测试期间不喂饵料、不换水，48 h后在解剖镜下观察幼溞存活情况，以幼溞的心跳停止作为死亡标准。各测试液设4个平行组，统计各测试组中溞的死亡数量，通过几率单位法计算48 h的三氯生对蚤状溞的半致死质量浓度（LC50）。

1.4 急性毒性试验与酶活和MDA含量测定

在获取48 h半致死质量浓度LC50的基础上，设置三氯生质量浓度为5，10，20，40、80和160μg/L的6个试验组并设置空白对照组，选取同一批次且大小一致的1日龄幼溞40只，分别放入盛有上述60 mL测试液的80 mL烧杯中，试验过程中不投饵，溶解氧质量浓度为5.0 mg/L，以上各质量浓度设4个平行组。

在三氯生处理24和48 h后，于冰上取样，吸干水分，加入生理盐水匀浆，4℃冷冻离心10 min后，取上清液测定SOD、CAT、GST活力和MDA含量，测定的方法参照试剂盒说明书，总蛋白含量测定采用考马斯蓝方法，以牛血清白蛋白作为标准品[6]。

1.5 数据分析

试验结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示，运用Sigmaplot 11.0软件进行分析和作图。采用单因素方差分析（One-WayANOVA）和Dunnett法对处理组与对照组进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 三氯生对蚤状溞的48 h急性毒性结果

结果显示，随着三氯生质量浓度的增加，蚤状溞的死亡率呈上升趋势。在质量浓度为100，200，400，800和1 200μg/L时，蚤状溞的死亡率分别为7.5%，20.0%，55.0%，92.5%和100.0%，蚤状溞的死亡率与三氯生质量浓度有明显的质量浓度效应关系。通过对数据进行Sigmoid 3 parameter拟合得方程y=97.5/[1+e（370.3-x）/115.22]，其中y为死亡率，%，x为三氯生质量浓度，μg/L，得出三氯生对蚤状溞48 h的半致死质量浓度为370.3μg/L，95%的置信区间为354.2～386.3μg/L（图1）。

图1三氯生对蚤状溞48 h急性毒性

2.2 三氯生对蚤状溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影响

三氯生对蚤状溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影响，见图2（a）（b）（c）（d）。SOD活性测定结果显示，三氯生对蚤状溞体内SOD活性具有显著影响（P＜0.05），蚤状溞暴露三氯生24 h后，随着质量浓度增加，SOD活性呈先增加后降低的趋势。与对照组相比，三氯生质量浓度为10，20和40μg/L时，SOD活性显著上升（P＜0.05），质量浓度为5和80μg/L时，SOD活性与对照组无显著差异（P＞0.05），质量浓度为160μg/L时，则出现显著下降（P＜0.05）；暴露48 h后，SOD活性变化趋势与暴露24 h后的情况类似，但与对照组相比，三氯生质量浓度为5和10μg/L时SOD活性显著上升（P＜0.05），质量浓度为20μg/L时SOD活性无显著差异（P＞0.05），质量浓度为40，80和160μg/L时则出现显著下降（P＜0.05）。

CAT活性测定结果显示，三氯生对蚤状溞CAT活性也具有显著影响（P<0.05）。蚤状溞暴露在三氯生24 h后，质量浓度为10，20和40μg/L时，CAT活性与对照组相比显著上升（P<0.05），但质量浓度为80和160μg/L时，CAT活性显著下降（P<0.05），质量浓度为5μg/L时，CAT活性与对照组相比无显著差异（P>0.05）；暴露48 h后，整体上，CAT活性较24 h变化较大。与对照组相比，三氯生质量浓度为5μg/L时，CAT活性无显著差异（P＞0.05），其他质量浓度下CAT活性的变化趋势则与暴露24 h时相似。

图2三氯生浓度对蚤状溞SOD、CAT、GST活性和MDA含量的影响

GST活性测定结果显示，三氯生对蚤状溞GST活性具有显著影响（P<0.05）。蚤状溞暴露于三氯生24 h后，质量浓度为5μg/L时，GST活性表现为显著上升，质量浓度为10和20μg/L时GST活性虽有下降，但与对照组无显著差异（P＞0.05），质量浓度在40，80和160μg/L时GST活性显著下降（P<0.05）；暴露48 h后，除质量浓度为5μg/L时，GST活性与对照组相比显著上升外（P<0.05），其他质量浓度组均与对照组相比出现显著下降（P<0.05）。

MDA含量测定结果显示，暴露于三氯生24 h后，MDA含量随三氯生质量浓度的升高呈上升趋势，其中40，80和160μg/L的试验组MDA含量较空白组出现了显著上升（P<0.05）；暴露于三氯生48 h后，MDA含量的变化趋势同暴露24 h时相似，其中20，40，80和160μg/L试验组MDA含量较空白组出现了显著上升（P<0.05）。

3 讨论

3.1 三氯生对蚤状溞的急性毒性影响

三氯生的使用对人类健康造成潜在风险，这一直是人们关注的问题，探讨三氯生对水生生物的毒性影响可为三氯生的风险评估提供依据，而急性毒性研究是评价有毒物质风险的基础。已有研究表明三氯生对泥鳅24和48 h的急性毒性LC50值分别为6.60和6.16 mg/L[7]；对东北林蛙48 h的急性毒性LC50值为1.102 mg/L[8]；对大型溞48 h的急性毒性LC50值为390μg/L；对草履虫48 h的急性毒性LC50值为476μg/L[3]。研究显示，三氯生对蚤状溞48 h的急性毒性LC50值为370.3μg/L，结果表明利用蚤状溞评价三氯生的急性敏感性较以上动物具有明显优势。

3.2 三氯生对蚤状溞主要抗氧化指标的影响

SOD可清除生物细胞内活性氧自由基（Reative Oxygen Species,ROS），在维持细胞ROS的质量浓度平衡中具有重要作用，SOD酶可使机体细胞免受氧化损伤，是机体细胞中抗氧化的关键酶。但当外界有毒物质质量浓度过高，导致生物体内ROS上升而又超出SOD酶清除能力时，细胞会受到损伤。因此SOD酶活性改变能及时反映外界有毒物质对溞氧化胁迫的程度[9]。研究中，随三氯生质量浓度的升高，蚤状溞体内的SOD活性在低质量浓度试验组表现出上升，在高质量浓度组则出现下降，暴露24 h后，三氯生质量浓度为5μg/L时，SOD活性无显著差异，这可能是由于短时间内低毒产生的毒性较少，机体能及时清除ROS，细胞可维持SOD活性的正常，但随着质量浓度升高或时间延长，三氯生对蚤状溞毒性加大，整体表现出低促进高抑制的现象。张楠等[9]研究重金属锌对大型溞24 h毒性作用和王茜等[10]研究工业废水对多刺裸腹溞毒性时，SOD和CAT活性变化趋势均较为相似。在该研究中，三氯生对蚤状溞体内CAT活性变化趋势的影响与SOD也较为相似。另外，研究显示，暴露48 h后，三氯生低质量浓度试验组（5μg/L），SOD活性较空白组显著升高，但CAT活性升高不显著。

GST是生物体内重要的解毒酶，催化谷胱甘肽（GSH）巯基与一些亲电物质如脂质过氧化产物及外源性有毒物质结合，以保护DNA，同时避免蛋白质受损。当生物受到轻度毒物污染时，体内的GST会诱导上升，对抗胁迫反应，但污染增加时其诱导作用将被破坏，因此GST常作为环境污染的标记物[11]。研究中，暴露24 h时，除三氯生质量浓度为5.0μg/L时可显著诱导蚤状溞GST活性上升，其他试验组GST活性则出现下降，且在40，80和160μg/L试验组出现显著下降；暴露48 h时，各试验组GST活性均显著下降，这可能是暴露时间延长或有毒物质量浓度增加，导致过量毒物进入机体，GST与毒性物质大量结合，引起解毒功能下降，在研究镉类对蚤状溞影响时[12]，GST活性也出现类似结果，因此GST作为污染物的标记物具有可行性。

MDA为脂质过氧化的最终产物，其含量反映脂质过氧化水平，显示细胞受损伤程度。研究中，暴露24 h时，MDA含量在三氯生质量浓度为40μg/L时开始出现显著上升；暴露48 h时，当三氯生质量浓度为20μg/L时，MDA含量即出现上升，这表明三氯生对蚤状溞MDA含量与其质量浓度和暴露时间有关，这一结果与纳米二氧化钛和铜对大型溞MDA含量的影响相似[13]。

综上，该研究表明三氯生对蚤状溞具有一定的毒性，蚤状溞可通过体内的生化指标对抗胁迫反应，如抗氧化系统中SOD、GST和CAT的活性及MDA含量变化，且GST对三氯生敏感度较其他指标高。利用蚤状溞评价三氯生毒性效应具有一定优势，其中抗氧化指标具有快速、敏感性强等特点，该结论对评价三氯生的毒性效应具有一定参考价值。