鲢腐败希瓦氏菌株的16S rRNA鉴定

刘群，王菁，刘桐山，霍文慧，冯守明

（天津市动物疫病预防控制中心，天津300402）

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）为我国著名四大家鱼之一，生长周期短，肉质鲜美，具有较高的经济价值，在我国被广泛养殖。随着高密度集约化养殖技术的进一步提高，放养密度不断增加，残饵、粪便等亦随之增多，加之水资源紧缺，水交换能力减弱，造成养殖水体富营养化，水质污染程度加剧，导致鲢病害频繁发生，死亡率逐年增高[1]。

目前已发现多种病害可对鲢产量和品质造成威胁，如细菌性败血症、鳃霉病、车轮虫病和指环虫病等。其中，细菌性败血症为鱼体感染革兰氏阴性菌造成的，其发病时间长，是鲢集约化养殖过程中危害较大的一类疫病[2]。文献［2-3］研究表明，该病主要由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）、产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、苏伯利气单胞菌（Aeromonas sobria）、弧菌（Vibriospp.）等多种细菌感染引起。

现应用平板划线法对患病鲢进行细菌分离，对分离菌株进行革兰氏染色、16S rRNA序列鉴定及系统发育树分析，获得一株腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）。该研究结果可为鲢细菌性败血症潜在致病源的研究提供理论依据和参考。

1 研究方法

1.1 病鱼来源

于2021年3月初，在天津市宝坻区某淡水养殖水库取鲢病例样品。患病鲢为12月龄左右，体长为（40±5）cm，体质量为（1.2±0.4）kg。养殖水库水温2～4℃，日死亡率约3%。

1.2 观察病鱼

疾病暴发时，现场观察病鱼，了解养殖水温、鱼龄、发病率、死亡率等情况。

1.3 寄生虫检查

用常规显微镜检查病鱼体内外有无寄生虫。对其鳃丝、体表黏液采取水浸片法，肝、脾、肾组织采用压片法，血液用涂片法，制片后置于显微镜下观察发病鱼体表、鳃和其他内脏组织有无寄生虫。

1.4 细菌分离培养、革兰氏染色及镜检

取症状典型的发病鱼活体，置于解剖盘中，检查其体表症状。使用75%酒精对病鱼体表消毒，无菌环境下采集其肝、脾、肾组织，于LB琼脂平板划线接种，28℃培养24 h；挑取形态基本一致的单菌落，再进行划线培养，获得纯化的病原分离菌株。将分离得到的菌株接种到LB液体培养基中扩大培养后，一部分加甘油于-80℃保存；另一部分进行革兰氏染色并置于显微镜下观察细菌形态；还有一部分用于16S rRNA序列的PCR扩增。

1.5 分离病原菌16S rRNA序列分析及系统发育树构建

（1）细菌基因组脱氧核糖核酸（DNA）提取及16S rRNA基因序列扩增。采用水煮法提取菌株基因组DNA，以通用引物27F/1492R为正反向引物，进行PCR扩增16S rRNA序列。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并将PCR产物送往金唯智生物科技有限公司进行测序。相关引物序列及检测方法信息见表1。

（2）细菌16S rRNA基因序列及系统发育树分析。将16S rRNA测序结果通过NCBI Blast检索系统进行序列同源性分析，同时在NCBI下载已公布的希瓦氏菌属的16S rRNA基因序列进行相似性比较，采用MEGA 7软件邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树。

1.6 相关病毒分子生物学鉴定

（1）核酸提取。切取濒死发病鱼鳃、肝、脾、肾组织并研磨，于1.5 mL RNase-free离心管中，挑取少量研磨液，使用全自动核酸提取纯化移液工作站（M5073,Eppendorf）提取样品核酸，采用超微量核酸测定仪（IMPLEN,German）测定其纯度及浓度。

（2）病毒PCR检测。参考鲤春病毒血症病毒（SVCV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）、鲤疱疹病毒II型（CyHV-II）相关检测方法，进行相对应病毒分子生物学检测，相关检测所用引物序列及检测方法见表1。

表1 PCR检测所用引物序列

2 结果分析

2.1 患病鲢临床症状及剖检病理变化

发病鱼普遍表现为静止不动，漂浮于水库浅水区水面，部分体表尾端溃烂，活力明显下降，其上下颌、鳃盖、鳍基部及鱼体两侧充血，腹部膨大，尾端肿大，肛门红肿。剖检可见腹腔内有淡黄色积水，肾脏出血甚至严重溃烂，脾肿大。

2.2 病原菌分离及革兰氏染色

通过平板划线法共分离到6株病原菌，其中肝脏中2株，脾脏中1株，肾脏中2株，尾端皮肤1株，分别编号为BD1-1—BD1-6。分离到的6株病原菌在LB平板上的菌体形态较为相似，均为表面光滑、边缘整齐的圆形不透明淡黄色菌落。革兰氏染色镜检观察发现，菌株BD1-1—BD1-6菌落形态一致，为短杆状细菌，均为革兰氏阴性杆菌。

2.3 寄生虫检测和分子生物学鉴定结果

经制片和显微镜观察，所检患病鲢组织均未观察到寄生虫。采用相关检测方法对2021年3月初采集的患病鲢组织样品进行SVCV、KHV、CyHV-II分子生物学检测。结果表明，患病鲢组织样品均未扩增出SVCV、KHV、CyHV-II特异性片段（未列出），为SVCV、KHV、CyHV-II阴性。

2.4 病原菌16S rRNA序列比对及系统发育树分析

鲢分离菌株16S rRNA PCR电泳见图1。由图1可见，以分离菌基因组为模板，采用PCR方法扩增16S rRNA序列，经琼脂糖凝胶电泳显示在1 500 bp左右有1条目的条带，与预期大小一致。从GenBank中选取最相似菌株的16S rRNA序列，与分离病原菌的测序结果进行序列比对，结果表明，鲢分离菌株BD1-1—BD1-6的16S rRNA序列与腐败希瓦氏菌序列相似度高达99%以上，其中，菌株BD1-5与腐败希瓦氏菌序列相似度99.72%。同时，选择其中测序序列最长的分离病原菌株BD1-5作为代表株进行后续系统发育树分析。

图1鲢分离菌株16S rRNA PCR电泳

鲢分离菌株BD1-5 16S rRNA系统发育树见图2。由图2可见，在绘制的鲢分离病原菌系统发育树中，菌株BD1-5与腐败希瓦氏菌（GenBank NO.:KY817253/KC607530/KY817252）同源性最高，亲缘关系最近，自然聚为一枝，最终判定BD1-5菌株为腐败希瓦氏菌。

图2鲢分离菌株BD1-5 16S rRNA系统发育树

3 讨论

近年来，在我国部分淡水鱼类养殖地区，养殖鱼类在越冬后的初春季节，频繁出现大规模暴发性死亡的现象，给水产养殖业造成了较大的经济损失。越冬后初春时节患病鱼种类比较多，如草鱼（Ctenopharyngodon idella）、斑点叉尾（Ietaluruspunetaus）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、异育银鲫（Carassius auratus gibelio）等摄食性鱼类，鲢鳙（Aristichthys nobilis）等滤食性鱼类。从患病鱼体分离获得致病菌主要包括：水性点状气单胞菌（Pseudomonas punctata）、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌、柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）等。

该研究应用流行病学调查、寄生虫学观察、细菌分离鉴定、分子生物学检测等多种方法对天津地区一淡水养殖水库养殖的鲢死亡病例进行诊断及分析，发现该菌株表型特征与腐败希瓦氏菌相一致，16S rRNA序列比对分析显示该菌株与腐败希瓦氏菌相似性较高（99.72%），从系统发育树中也可见其与腐败希瓦氏菌菌群发生聚类，由此说明两者之间确实存在较近的亲缘关系。至于从患病鲢分离获得的此菌株是否为此次事件的致病源，以及其如何防治等问题仍有待进一步研究和探讨，但据现有结果可以推断，此株腐败希瓦氏菌是导致养殖鲢发病死亡的潜在致病源。

腐败希瓦氏菌于1985年由MacDonell和Colwell根据5S rRNA序列进行系统发育分析，其归属于希瓦氏菌（Shewanellaspp.）[8]，因被作为冷藏海水鱼的主要腐败菌而被人们所熟知[9-12]，相比之下，作为病原菌却鲜为人知。研究表明，腐败希瓦氏菌是一种人畜共患病病原菌，可引起人类软组织感染、心膜炎等[13-14]。其作为淡水养殖动物的病原菌，却较少见到有关腐败希瓦氏菌感染淡水养殖动物的报告。在国外，Koziñska等[15]发现鲤（Cyprinus carpio）和鳟（Oncorhynchus mykiss）的感染病例；国内在养殖河蟹（Eriocheir sinensis）[16]、异育银鲫[17]、大鲵（Andrias davidianus）[18]、草鱼[19]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[20]、乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）[21]等水生动物中发现过该菌感染所致的疫病。

4 建议

病害防控应建立在对病原进行分离和鉴定的基础上，只有快速、准确地判断病原的种类，才能采取有效的防控措施。针对水生动物细菌性疫病的治疗，水产养殖人员一直依赖消毒剂和抗生素，但近年来抗生素在水产品领域产生了诸多负面影响。因此，养殖过程中，应尽量避免使用抗生素，选用微生态制剂改善水质，调节鱼体肠道内微生物的生态平衡，提高鱼体免疫力。在对水库等大水面养殖鱼类进行细菌性败血症防治的过程中[2，22-24]，可参考如下措施。（1）加强水质管理。通过加注新水调节水位，确保春季水温稳定，避免水温剧烈变化引起鱼苗产生应激反应。（2）科学投喂优质饲料。春季水温上升时，根据养殖鱼的数量、规格和摄食能力，逐步增加投喂量，同时使用微生态制剂来提高鱼体自身的免疫力，确保水质稳定。（3）规范转塘和鱼种投放操作。尽量避免捕捞和转运过程中对鱼体造成机械损伤，放苗前使用食盐或聚维酮碘等对鱼苗进行消毒，控制鱼苗密度，加强管理，防止鱼苗产生应激反应。（4）控制养殖密度，避免因密度过大引起缺氧。关注天气变化，勤查水质状况，鱼体活动及摄食情况，防止疫病暴发。（5）加强病害防控。入春以后鱼体易受真菌、细菌等感染，应定期泼洒生石灰消毒，使用微生物制剂改良水质。（6）强化无害化处理。对病死鱼须及时使用生石灰做无害化处理，防止病原进一步传播；对养殖水库和有关工具须做彻底消毒和暴晒，严禁随意排放发鱼病水库的水体，杜绝病原扩散。