代谢性疾病及心脑血管疾病尿外泌体的变化及机制研究进展

陈晓依 赵靖宇 陈树春

1.河北北方学院研究生学院，张家口，075000，中国

2.河北省人民医院内分泌科，石家庄，050051，中国

3.华北理工大学研究生学院，唐山，063210，中国

2015 年国家卫计委提出的《中国疾病预防控制工作进展报告》中指出：慢性病已经成为我国居民头号健康威胁，其中糖尿病及相关并发症、心脑血管疾病等已成为主要死亡原因。近年来，伴随着分子检测技术的快速发展，外泌体在慢性病中的调控作用和临床诊疗日益受到研究者的关注。

外泌体（exosomes）是细胞主动分泌到微环境中的，体积较小、具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡，可自由通过各种生理屏障，其内含有的蛋白、核酸和脂质等可调节靶细胞的生物学功能，参与细胞间通讯及免疫调节，在各种生理及病理过程中具有重要作用。外泌体在体液中广泛分布，如：血液、尿液、脑脊液、羊水、乳汁及唾液等。其中尿液具有样本量多、取样方便且稳定性高等多种优点，相对于其他体液是更理想的各种疾病生物标记物的来源［1］。最新研究表明，尿外泌体参与了慢性病（糖尿病、高尿酸血症、高血压、心肌损伤、阿尔茨海默病、帕金森综合征等）的发生发展，同时对尿外泌体中蛋白质、核酸及脂类的检测对疾病的早诊断、早治疗和预后判断有很大的帮助［2］。因此，本文就尿外泌体在代谢性疾病及心脑血管疾病中的最新研究进展作一综述，并探讨其相关调控机制。

1 尿外泌体

1.1 外泌体的信息交流方式

外泌体是来源于细胞的膜性小泡，目前认为外泌体与靶细胞有3 种作用方式［3-4］：①外泌体可直接与靶细胞膜融合；②外泌体通过与细胞膜表面的受体相互作用进入细胞内，并刺激靶细胞及其下游的信号通路；③外泌体能被靶细胞内吞进入胞内，并在靶细胞内重新被释放或经溶酶体途径降解。

1.2 尿外泌体的组成成分

尿外泌体是最早由Pisitkun 等用超速离心法分离纯化得到的，并用全液相色谱-串联质谱分析揭示了正常人尿外泌体含有295 种蛋白质，随着技术的进步，Wang 等［5］利用多维蛋白质鉴定技术对尿外泌体进行蛋白质组学分析，结果鉴定出3 280 种蛋白质，其中9 个人之间有31%的重叠，即共同含有1 000 多种蛋白质，为未来的研究提供了可靠的参考价值。尿外泌体携带母细胞来源的特异性蛋白，如Wilms’肿瘤基因-1（wilms’tumor-1，WT1）、近曲小管的3 型Na-H 交换 器（Na+/H+-exchanger 3，NHE3）、水通道蛋白-1、髓袢升支粗段的2 型Na-K-2Cl 共转运体（Na+-K+-2Clcotransporter 2，NKCC2）、远曲小管的Na-Cl 共转运体（Na-Clcotransporter，NCC）和集合管的上皮钠通道（epithelial sodium channel，ENaC）等。因此检测尿外泌体携带的组织特异性蛋白质能反映靶细胞现阶段的状态、病变部位及程度［6］。此外，外泌体中还含有蛋白、核酸（miRNA、mRNA、lncRNA、DNA）、脂质等活性分子。因尿外泌体的蛋白质或RNA 在不同疾病中的表达不同，且具有稳定性高、敏感性强的特征，从而成为诊断疾病理想的标记物，甚至有可能成为未来靶向治疗的载体。

2 尿外泌体在代谢性疾病中的应用

2.1 糖尿病

糖尿病是一组以血糖水平高为主要表现的内分泌代谢性疾病，其并发症可危及生命。最近的研究证明，尿外泌体与糖尿病及其相关并发症的发生关系密切，尤其在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）方面。大多数研究认为高血糖和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）参与了DN 的关键信号通路及基因表达。Wang 等［7］发现，肾小球系膜细胞在高糖环境下比正常环境下分泌的外泌体更多，且外泌体中含的TGF-β1 mRNA 更高，其可激活足细胞内磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路，诱导足细胞凋亡及黏附抑制。Abe H［8］对糖尿病患者尿外泌体中WT1 蛋白的表达进行了检测，发现WT1 蛋白随患者肾功能的降低反而上升，并可对糖尿病患者肾小球足细胞的损伤进行有效反映，提示尿外泌体可作为DN 早期诊断的非侵入性标记物。研究还指出，尿外泌体中WT1 蛋白mRNA 水平可预测DN 患者肾小球滤过率的下降速度。此外，研究发现尿外泌体中miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p 和miR-15a-5p 可作为DN 早期的无创标记物［9］。

2.2 高尿酸血症

研究发现尿外泌体源性microRNA 在高尿酸血症的诊断中也起到重要的作用。胡艳艳等［10］检测了高尿酸血症患者尿液外泌体microRNA 的表达，与正常对照组相比，结果发现10 种已知 microRNA 表达差异（P<0.05），其 中miRNA-32 表达上 调，而miR-1246、miR-3615、miR-1、miR-204、miR-126、miR-320d、miR-320c、miR-3158、miR-6510 表达下调，提示以上尿外泌体携带的microRNAs 可能参与了高尿酸血症的发生发展，将来有可能成为高尿酸血症有价值的生物标记物。然而该研究纳入的人群较少，需要大量的临床试验研究证实，同时需要深入的研究进一步探讨尿外泌体源性的microRNA 在高尿酸血症的作用及潜在的调节机制，为高尿酸血症发病机制的研究提供参考。

3 尿外泌体在心血管系统疾病中的应用

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）引起30% 以上的全球死亡人数。在CVD 患者中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生会增加。Agudiez 等［11］首次对CVD 患者和正常对照的尿外泌体代谢组学进行分析，结果发现在CVD 患者的尿外泌体中4-氨基马尿酸水平比正常人升高，而N-1 甲基烟酰胺和柠檬酸水平降低。其中4-氨基马尿酸水平增加可能与较高 ROS 产生及炎症有关，而N-1 甲基烟酰胺具有血管舒张特性，可发挥抗血栓和抗炎作用，成为动脉粥样硬化发生、发展的分子指标。柠檬酸水平降低可使三羧酸循环代谢失调，促进蛋白尿的产生，进而导致顽固性高血压，甚至可能加重CVD 患者慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的发生。综上，尿外泌体的代谢产物含量可以预测心血管疾病发生的风险。实验证明尿液作为CVD 生物标记物的来源研究具有很大潜力。

3.1 高血压

高血压能造成严重的心血管疾病，引发了全球的关注。有原发性高血压和继发性高血压，其中原发性高血压的病因不明确，研究发现遗传、内皮功能障碍、血管重塑、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活等均与高血压的发生有关，但其分子机制依然不明确。最近研究表明，高血压的发生、发展中尿外泌体起着重要作用。

目前，尿源性外泌体在高血压中的研究相对于循环外泌体的研究多，可能是尿液中的外泌体由肾及泌尿生殖道各种上皮细胞分泌，且大多数蛋白-钠转运体位于肾上皮的顶端质膜上［12］。研究显示，尿外泌体内钠转运蛋白与高血压密切相关。尿外泌体内含有NHE3、NKCC2、NCC 和ENaC，以上转运蛋白在维持电解质平衡及血压调节中发挥了重要作用。这些转运蛋白的改变会导致特殊类型高血压的发生，如假性醛固酮增多症、醛固酮增多症。患者尿外泌体的磷酸化水平比正常人明显升高，其机制在醛固酮的作用下，促进肾的钠转运体上的NCC 和ENaC 蛋白磷酸化并移位到尿外泌体内，提示尿外泌体可作为高血压疾病的一种新的无创性诊断标记物［13］。Perez-Hernandez 等［14］通过比较大量的高血压患者与正常人尿液样本发现，尿外泌体miR-26a 水平与蛋白尿呈负相关，提示尿外泌体miR-26a 可能是研究高血压早期肾损伤的潜在有用工具。此外，大多数研究表明高血压患者尿外泌体的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 等多种miRNAs 对血压波动较敏感，并且被认为是尿外泌体中所特有的，提示尿外泌体的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 可以作为是血压盐敏感性和逆盐敏感性的新型标记物［15-16］。

3.2 心肌损伤

心肌损伤可诱导心肌细胞死亡。近年来，外泌体miRNA 作为缺血性心脏病的诊断和预后的生物标记物，成为了缺血性心脏病研究热点之一。microRNAs（miRNAs）是一种小的（<24 个核 苷酸）RNA，具有很强的生物学功能。研究显示，尿液中存在外泌体miRNAs，它们来源于泌尿生殖以外的细胞，经血液循环到达肾脏，最终以尿外泌体的形式排出体外［17］。血清及尿液外泌体中多种miRNAs，在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者表达显著升高，如miR-1、miR-208、miR-194、miR-34a 及miR-499，其中miR-34a、miR-194 与AMI 患者合发右心衰关系显著。研究证实了心脏释放的miRNAs 可以通过肾释放进入尿液，提示尿外泌体中的miR-1、miR-194、miR-208、miR-34a 及miR-499 可能代表了一组新的缺血性心脏病的尿液生物标记物［18］。

4 尿外泌体在中枢神经系统疾病中的应用

4.1 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以记忆减退合并认知障碍为特征的神经系统变性疾病。AD的发病机制十分复杂，目前认为与β淀粉样蛋白参与形成淀粉样老年斑、Tau 蛋白过度磷酸化聚集成双螺旋变成神经纤维缠结及神经功能退行性病变等密切相关，外泌体则参与了β淀粉样蛋白和Tau 蛋白在机体内的代谢、转运等过程［19］。目前对阿尔茨海默症尿外泌体蛋白质组学的报道并不多，吴利等［20］首次采用液压透析与超高速离心两种方法联合提取分离AD 患者尿液外泌体，并通过蛋白质组学的方法对AD 患者与对照组尿外泌体的差异蛋白进行分析，提出与机体炎症相关的尿外泌体alpha-1-antichymotrypsin、ceruloplasmin、protein S100-A8、protein S 100-A9 与细胞骨架相关的尿外泌体annexin A2 等五个蛋白可作为AD 的生物标记物。

4.2 帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）成为排名第二的老年人常见神经系统疾病。研究表明PD 典型病理改变是路易氏体的形成，而α-核突触蛋白（alphasynuclein，α-Syn）是其主 要成分［21］。α-Syn 可能通过富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）介导的自噬和细胞内吞途径致病，而LRRK2基因的表达被证实与外泌体的合成和分泌有关［21］：LRRK2 与内吞蛋白Rab5b 可互相作用调节内体囊泡转运。在PD 患者的尿液中可以检测到LRRK2 蛋白外泌体，这表明LRRK2 蛋白的分泌又依赖于外泌体。

目前，有关PD 认知障碍的尿液生物标记物研究较少，Fraser 等［22］收集了79 例已排除LRRK2 基因突变的PD 患者和79 例健康受试者的尿液，结果发现PD 患者尿外泌体磷酸化LRRK2 水平高于健康受试者，且磷酸化 LRRK2 水平越高，PD 患者认知功能及日常活动能力越差。而Ho 等［23］在PD 患者尿外泌体未检测到α-Syn，且发现PD 患者尿外泌体中的DJ-1 和LRRK2蛋白与健康受试者无明显差异，男性PD 患者尿外泌体中DJ-1 蛋白水平较男性健康受试者增高，但尿外泌体中的DJ-1 蛋白是否可作为男性PD 患者的候选生物标记物，需要不断探索和研究。

5 总结和展望

尿外泌体作为慢性疾病的新型诊断标记物具有很多优势，尿外泌体携带有特异性的蛋白质、核酸和脂质，它的脂质双分子层结构可以保护内部循环的miRNA、mRNA、DNA 片段及功能性蛋白等活性物质，取样容易且稳定存在于尿液中，因此可用作各系统疾病的诊断和预后的潜在生物标记物［1］。近年来，虽然尿外泌体在各系统疾病的发生发展中取得一定的成果，但在临床应用方面仍然面临着很多挑战，需要更高效、更标准化的外泌体分离和鉴定技术。提取尿外泌体有差速超速和密度梯度离心法等，这些提取方法还有许多不足，如产量低、耗时长等。但随着对尿外泌体在慢性疾病研究中的不断深入及分子检测技术的飞速发展，尿外泌体作为新型生物标记物在慢性疾病的早期诊断和预后评估必然发挥关键作用，甚至有可能成为疾病诊疗的新方向。