ALK免疫组化切片重复利用进行FISH检测的可行性

杨清麟，刘子臣，刘 辉，吴林果，胡艳萍

目前肺癌是全球发病率和病死率增长较快的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%以上，约5%的NSCLC出现间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)重排[1]。近年来克唑替尼等ALK基因靶向药物临床发展迅速，对晚期NSCLC患者疗效显著。晚期肺癌患者通常无法进行手术，临床活检组织标本、细胞学标本的珍贵性不言而喻。免疫组化是病理科常用的检测方法，经济实用，方便快捷，适合ALK基因重排检测的初筛；荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测作为国际公认标准，对ALK基因重排的确诊具有重要意义。本实验通过对肺癌切片经免疫组化染色后再行FISH检测，与直接对切片进行FISH检测的结果进行比较，探索针对ALK基因重排指标免疫组化染色后切片重复利用进行FISH检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料选取肺癌患者的气管镜活检标本、细胞学标本各20例，每例标本切片分为对照组和实验组。对照组直接对切片行FISH检测，实验组先行免疫组化染色，再对同一张切片进行FISH检测。

1.2 方法(1)免疫组化染色：ALK抗体购自北京中杉金桥公司，显色系统为PV-6000D，采用EnVision两步法染色，切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，EDTA(pH 9.0)中高温高压修复2.5 min，过氧化氢溶液中处理10 min，一抗37 ℃孵育1 h，二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色5 min，苏木精复染后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封片。(2)FISH检测：ALK探针为雅培公司生产，前处理试剂均购自金箓生物公司，切片经二甲苯脱蜡，无水乙醇漂洗后晾干，预处理液80 ℃ 12 min，胃酶37 ℃消化25 min，梯度乙醇脱水后晾干，滴加探针75 ℃变性5 min，37 ℃杂交过夜，含0.3%NP-40的2×SSC洗液常温浸泡5 min后移除去盖玻片，72 ℃洗液2 min洗去未结合的探针，暗处风干后，滴加DAPI复染细胞核并封片，30 min后用荧光显微镜读片。(3)同一切片免疫组化染色后FISH检测：切片先行免疫组化染色，同步骤(1)，1周后将已封片的免疫组化切片放入二甲苯中浸泡1～2天，等待盖玻片自然脱落，无水乙醇漂洗后，省去预处理步骤，直接37 ℃胃酶消化25 min后同步骤(2)。

1.3 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验组与对照组FISH检测结果使用Kappa一致性检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

细胞学标本：对照组检出FISH阳性5例(25%)，FISH阴性15例(75%)；实验组检出FISH阳性3例(15%)，FISH阴性17例(85%)(图1)。活检标本：对照组检出FISH阳性7例(35%)，FISH阴性13例(65%)；实验组检出FISH阳性6例(30%)，FISH阴性14例(70%)(表1，图2)。细胞学标本实验组与对照组FISH结果一致性较好(Kappa系数=0.692，P<0.05)，活检标本实验组与对照组FISH结果一致性很好(Kappa系数=0.886，P<0.05)。从实验结果图来看，将进行过免疫组化染色的切片再重复利用行FISH检测的切片与直接用白片行FISH检测的结果一致。

表1 对照组与实验组ALK FISH检测结果对比

图1 细胞学标本：A.实验组ALK免疫组化阴性结果，EnVision两步法；B.实验组免疫组化染色后再行FISH检测的阴性结果；C.对照组直接行FISH检测的阴性结果 图2 活检标本：A.实验组ALK免疫组化阳性结果，EnVision两步法；B.实验组免疫组化染色后再行FISH检测的阳性结果；C.对照组直接行FISH检测的阳性结果

3 讨论

研究表明，ALK重排阳性多见于较年轻、吸烟较少甚至不吸烟的肺腺癌患者。棘皮动物微管相关蛋白-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK)是ALK基因重排最常见的融合形式[2]。ALK基因靶向药物的上市，显著延长了ALK基因突变的晚期NSCLC患者生存期，这也使ALK基因重排的检出具有重大意义。晚期肺癌患者在临床使用ALK抑制剂之前，大多需行FISH检测确定ALK基因是否重排。少量的肺癌活检标本通常在前期行HE、免疫组化染色后已所剩无几，导致无法进行FISH检测确诊，从而影响患者的靶向治疗。

免疫组化检测ALK表达使用抗体与蛋白质结合，着色部位定位于细胞质。FISH技术是荧光标记的特异性核苷酸片段与切片中的基因组DNA杂交[3]，利用碱基互补配对原则，探针在细胞核内与靶基因结合。理论上两种检测方法应该互不影响，由于免疫组化检测中已经进行过高温高压修复，因此在FISH检测中省去预处理步骤，直接从胃酶消化过程开始进行[4]。

从FISH检测结果图片来看，实验组的细胞数量稍低于对照组的细胞数量，可能是由于过多的实验流程导致少部分细胞在处理过程中丢失，这也是此项方法在实际应用中的局限所在。

综上所述，通过对免疫组化染色后切片重复使用，发现其FISH结果可信度较高，能为临床治疗提供可靠依据，为难以获取标本的晚期NSCLC患者能否进行ALK靶向治疗提供有力的支持，从而提高患者的生存期，也为其他样本稀缺的晚期癌症患者后续进行临床分子检测提供了一种新的方法和思路。