碳化方法消除透射电镜生物样品中锇黑颗粒的体会

张彩丽，刘湘花，李 欣，孙 宁，高鸿建

锇酸后固定是生物电镜样品制备中的关键环节。如果锇酸固定后清洗不彻底，则在乙醇脱水过程中会出现组织内的四氧化锇被还原成二氧化锇并沉淀在组织内，电镜下呈现黑色的细小颗粒(锇黑颗粒)。这种人工假象不但掩盖了组织结构的细节，而且混淆结果的判断。本实验通过对比常规方法前处理和碳化方法前处理结果，分析碳化方法前处理在避免出现锇黑颗粒方面的优势，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本 收集2017～2019年河南中医药大学中医药科学院电镜中心接收的送检实验动物标本825例，其中包括肺、肾、心、脑、肝组织，其中行常规方法前处理组600例，碳化方法前处理组225例。

1.1.2主要仪器设备 日本电子JEM-1400生物透射电镜、徕卡全自动树脂处理机(LeicaEMTP)、徕卡全自动超薄切片机(LeicaEMUC7)戴通钻石刀、琅玕智能电热恒温培养箱(DHP-9050B)、超纯水机(Milli-Q)、离心机(长沙湘智TGL16)、碳化船舱(自制)。

1.1.3试剂 (1)812环氧树脂；(2)丙酮；(3)梯度乙醇；(4)0.1 mol/L PBS(pH 7.2)；(5)1%锇酸水溶液；(6)醋酸双氧铀染液；(7)柠檬酸铅染液。

1.2 方法

1.2.1组织树脂块制备 组织送检时已用2.5%戊二醛固定4～24 h，按前处理流程分为常规方法前处理和碳化方法前处理。(1)常规方法前处理流程。①PBS漂洗：15 min×4次；②后固定：1%锇酸内浸泡固定1.5 h；③PBS漂洗：15 min×4次；④梯度乙醇脱水：50%→70%→80%→90%乙醇各15 min→100%乙醇15 min×2次→100%丙酮15 min×2次；⑤浸透：1 ∶1→2 ∶1树脂丙酮各2 h；⑥包埋：硅胶板内纯环氧树脂包埋；⑦聚合：37 ℃ 12 h→45 ℃ 12 h→60 ℃ 24 h。(2)碳化方法前处理流程：操作步骤引自“生物电镜样品碳化方法”(中国专利CN201410183132.2)[1]，具体操作由专利发明人高鸿建老师指导。

1.2.2超薄切片与铅铀双染色 用电动砂轮打磨掉组织周边多余树脂后在显微镜下用刀片将组织头修切成锥形，然后在超薄切片机上切出70 nm厚的薄片，铜网捞片，晾干；铅-铀双染色；电镜下观察拍照。

1.3 结果判定细胞内出现非结构性散在或密集的点状高电子密度颗粒为阳性。

2 结果

常规方法前处理组600例中锇黑颗粒阳性标本57例，肺、肾、心、脑、肝组织细胞内均出现大量锇黑颗粒沉淀，颗粒密集杂乱，与游离核糖体相参杂，遮盖了局部细胞器超微结构的细节，对结果的分析造成了干扰(图1)；碳化方法前处理组225例中锇黑颗粒阳性0例，各组织细胞内超微结构清晰(图2)。

图1 常规方法前处理组：A.肺泡隔胶原原纤维之间、毛细血管内皮细胞及血管腔内大量锇黑颗粒沉淀，颗粒密集，与游离核糖体相参杂；B.脑组织内突触小体及突触小泡内充满杂乱无章的锇黑颗粒；C.肾小管上皮细胞内充斥着大量的锇黑颗粒，遍布线粒体内；D.肝脏组织中锇黑颗粒分布在肝细胞线粒体、内质网、糖原区各个角落；E.心肌细胞内锇黑颗粒分布在心肌粗、细肌丝及线粒体内 图2 碳化方法前处理组：A.肺组织内无锇黑颗粒沉积；B.脑组织内无锇黑颗粒沉积；C.肾小管内无锇黑颗粒沉积；D.肝组织内无锇黑颗粒沉积；E.心肌细胞内无锇黑颗粒沉积

3 讨论

透射电镜生物样品观察需要高质量的超薄切片，并尽量减少人工假象[2]。样品制备过程包括取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等诸多步骤，过程中使用的化学试剂种类繁多。为获得理想的超薄切片，操作者必须谨慎对待每一步骤，任何环节的疏忽均有可能导致制片失败[3]。在实际工作中，我们经常会碰到各种各样的问题，如污染、人工假象等。因此不断提高制片质量也是电镜工作者不断追求的目标。刘湘花等[4-5]在超薄切片染色方法的改进中指出多个染色细节，减少了染色污染几率，并从超薄切片厚度、电镜物理参数优化等方面进行探索，总结了几点提高生物电镜样品图像反差及清晰度的经验。李宁宁等[6]则强调了钻石刀在生物样品超薄切片制备中的优势，并指出其在提高制片质量方面的使用技巧与注意事项，这些经验对我们的实际工作有很大帮助。

锇黑颗粒作为一种人工假象，时下已成为电镜同仁热议的话题，锇黑颗粒来自锇酸的不当残留。锇酸对生物样品有固定和电子染色双重作用，具有很强的挥发性，用锇酸固定时，组织结构与锇离子结合，获得高反差电子图像[7-8]。锇酸浸泡固定时锇酸分子分散在组织内，若漂洗不充分，锇酸则残余在组织内，乙醇脱水时，四氧化锇被还原成二氧化锇，组织内就形成了锇黑颗粒沉淀。另外，采用戊二醛-锇酸双固定时，在锇酸固定之前，需将残余在组织内多余的及结合不牢的戊二醛漂洗干净，否则它们将与锇酸反应，产生细小而致密的锇沉淀使组织结构遭受破坏。根据这些原理，为避免锇黑颗粒的出现，作者曾使用梯度丙酮取代梯度乙醇脱水以及多次长时间漂洗的方案，结果发现这两种方案虽能在一定程度上减少锇黑颗粒，但却无法杜绝。而且由于丙酮对组织的抽提，出现了组织块变脆，超薄切片困难，组织难以成片的问题，而长时间的漂洗又出现了组织水肿等问题。

碳化方法是复旦大学基础医学院电子显微镜中心实验室高鸿建老师的专利发明。运用碳化方法进行前处理的优点：(1)从根源上杜绝了锇黑颗粒的出现。一方面碳化过程中采用锇酸熏蒸方法，组织并非浸泡于锇酸溶液中，避免了由于组织内外锇酸浓度差造成的过多锇酸分子在组织内残留而形成锇黑颗粒。另一方面省去了乙醇脱水步骤，在根源上杜绝了锇黑颗粒沉淀产生的因素；(2)对组织结构尤其膜结构显示更加清晰；(3)无锇酸后固定之后的漂洗，杜绝了因漂洗过度带来的组织水肿破坏；(4)碳化方法流程简单，节约试剂耗材，尤其是锇酸的使用量明显减少，且可以多次重复使用，从而间接地保护了工作人员。使用碳化方法前处理时需要注意：(1)组织块大小不同对碳化时长要求不同，一般为0.5～2 h不等，1 mm×1 mm×1 mm的样品需碳化1 h，稍大的或者含胶原较多的组织块需碳化2 h，肾穿刺样品需碳化0.5 h；(2)组织成分不同碳化时长亦不同：植物样品成分与动物样品成分不同，碳化时间需要延长。

需要强调的是并非常规方法前处理方案处理后标本中就一定会出现锇黑颗粒沉积，各实验室应根据自身情况摸索出适合本实验室的样品处理条件，如遇顽固性锇黑颗粒困扰，碳化方法不失为一种良好的挽救方法。