江苏徐州地区鸭浆膜炎分离鉴定

赵晓锦，王姣，杨海明

摘 要：疫病防控是畜牧生产中非常重要的一环，浆膜炎症作为困扰鸭养殖的一种疾病，亟待解决。本研究对徐州地区鸭浆膜炎病例进行细菌分离培养、PCR鉴定，并对分离到的11株鸭疫里默氏杆菌和19株大肠杆菌进行血清型鉴定。试验结果明确鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌是引起浆膜炎的主因，徐州地区鸭疫里默氏杆菌的主要流行株为Ⅱ型和Ⅰ型，分离到的19种大肠杆菌血清型均不相同。研究结论为鸭浆膜炎的预防控制提供参考。

关键词：樱桃谷鸭;安全生产;浆膜炎;鸭疫里默氏杆菌;大肠杆菌

中图分类号：S858.32        文献标识码：B        文章编号：1673-1085（2021）7-0042-04

疾病是威胁鸭养殖产业的一个重要因素，鸭传染性浆膜炎流行广泛，危害严重，给鸭养殖产业造成巨大的经济损失。低饲养密度加上良好的卫生环境以及全进全出的饲养方式下，鸭传染性浆膜炎发病率较低[1]。但近年来，随着鸭养殖规模不断扩大，养殖密度增大，鸭传染性浆膜炎的流行率呈现升高趋势[2]。随着养殖规模的扩大，疫病频发造成药物使用频繁，盲目用药导致无药可用[3]。农业农村部第194号公告明确剔除了除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。未来养殖的发展趋势必定是减抗，而疫苗的正确选用能够推进减抗发展。为了推进畜牧业良好技术的研究和推广，本文通过探索2019年徐州地区浆膜炎症的发病原因，鉴定鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌的血清型，分析徐州地区流行菌株，为选择最佳防病防疫程序提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 江苏徐州以及周边地区自养殖场。

1.1.2 检测试剂 胰酪大豆胨琼脂、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂、胰酪大豆胨液体培养基等试剂购自青岛海博生物技术有限公司。细菌琼脂粉，购自北京陆桥技术股份有限公司;氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司;小牛血清，购自平睿生物科技有限公司。2×含染料Taq预混PCR反应体系，StarGreen核酸染料10000×，50×TAE DNA Electrophoresis Buffer，购自GenStar北京康润诚业生物科技有限公司。琼脂糖，购自广州赛国生物科技有限公司。革兰染液，购自北京索莱宝科技有限公司。

试剂均按说明书制备要求进行配制。

鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌上下游引物，由江苏桂柳牧业集团有限公司提供，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

鸭疫里默氏杆菌血清Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅶ型定型血清，大肠杆菌O血清因子为O78，均由山东农业科学院家禽研究所提供。未检测出大肠杆菌由江苏桂柳牧业集团有限公司送外检测（江苏农牧科技職业技术学院）。

1.1.3 试验仪器 DNP-9082电热恒温培养箱、CX23光学显微镜、TC-96/G/H（b）C基因扩增仪、Tanon-1600全自动数码凝胶图像处理系统、M1-L213B微波炉、HE-120水平电泳槽、ESP-300水平电泳仪、721N分光光度计、LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 对送检的病死鸭进行解剖，取内脏和脑进行无菌分离，接种于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨琼脂平板，置玻璃干燥皿中，皿中放入点燃蜡烛，放在37 ℃培养箱培养24～48 h，观察菌落形态。对分离出的细菌进行纯化，对疑似鸭疫里默氏杆菌或大肠杆菌的菌落进行染色，革兰染色后使用光学显微镜1000×油镜下观察，记录细菌形态。将疑似大肠杆菌的菌落划在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板上，置于37 ℃的温箱培养24 h，观察菌落颜色、形态。

1.2.2 分子鉴定 取纯化后疑似和未鉴定的细菌作为模板，设置鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。

PCR反应体系为10 μM上下游引物（表1）各0.5 ?L、2× Taq PCR StraMix 12.5 ?L、dd H2O 9.5 ?L、模板2 ?L。

PCR反应条件设置为94 ℃预变性2 min;94 ℃变性 30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保温至停止反应。

取PCR反应产物3 ?L，加入含StarGreen核酸染料的1 %琼脂糖凝胶板样品孔中，放入水平电泳仪中，150 V稳压电泳 30 min，凝胶成像处理系统观察结果。

1.2.3 血清型鉴定

1.2.3.1 抗原制备 取分离纯化后的大肠杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基中，鸭疫里默氏杆菌接种于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37 ℃培养箱培养24 h，100 ℃水浴2 h，5000 r/min离心20 min，取上清，制备成相应的抗原。

1.2.3.2 鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定 用生理盐水配制1.5 %琼脂板，梅花打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂，用酒精灯微烤平板底部封底。在中心孔中加入10 ?L鸭疫里默氏杆菌血清，在周围孔加入10 ?L制备抗原。将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37 ℃温箱内放置 24 h后观察结果。

1.2.3.3 大肠杆菌血清型鉴定 分别取10 ?L菌体抗原和大肠杆菌O78血清置于玻板上混匀。明显凝集者为阳性，同时以菌体抗原与生理盐水混合物作阴性对照。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

2019年从徐州及其周边接收到剖检疑似浆膜炎病例32份，有27份分离到疑似鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌菌落，在含5 %小牛血清的胰酪大豆胨琼脂平板上进行分离培养，圆形边缘整齐，表面光滑，透明，菌落较小，边缘泛荧光，生长较慢，在32 h后生长才较好，判定为鸭疫里默氏杆菌疑似菌落（图1 A）;圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起，生长较快，16 h内生长较密，判定为大肠杆菌疑似菌落（图1 B）。革兰氏染色后使用光学显微镜1000×油镜下观察，鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性杆菌，菌体较小，少数呈双排列或长丝状（图1 C）。大肠杆菌为革兰氏染色阴性、两端钝圆的短小杆菌，多单在、偶有2～3个菌体相连（图1 D），所有疑似大肠杆菌的菌落在麦康凯琼脂平板上均呈桃红色（图1 E），在伊红美蓝琼脂平板上均呈现金属光泽（图1 F）。而疑似鸭疫里默氏杆菌在两种培养基上均不生长。

从徐州市及其周边搜集到的32份浆膜炎疑似病例检测出鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌菌落阳性率为84.4 %（27/32）。其中，大肠杆菌和鸭疫里默氏杆混合感染为2例，表明大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌是引起浆膜炎的主要原因。大肠杆菌分离到19例，占相关病例的59.4 %，且多引起产蛋鸭产蛋下降，说明大肠杆菌对种鸭的危害大于鸭疫里默氏杆菌，此外，通过临床剖检发现浆膜炎亦是造成鸭腿病的重要致病因素。

2.2 分子鉴定结果与分析

分别对11株鸭疫里默氏杆菌菌株及19株大肠杆菌菌株进行PCR验证，其中鸭疫里默氏杆菌目的条带为690 bp，鸭疫里默氏杆菌PCR鉴定结果见图2 A;大肠杆菌目的条带为400 bp，大肠杆菌PCR鉴定结果见图2 B。PCR阳性对照送生工生物工程（上海）股份有限公司检测确定为阳性。

2.3 血清型鉴定结果与分析

2.3.1 鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定结果与分析 鸭疫里默氏杆菌抗原与阳性血清抗体孔间形成一条沉淀线，说明鸭疫里默氏杆菌抗原与相对应的血清抗体可以发生特异性结合，表明鸭疫里默氏杆菌对应的血清型为阳性血清的血清型。徐州及周边地区鸭疫里默氏杆菌血清型比例见表2。

鸭疫里默氏杆菌主要血清型为Ⅱ型和Ⅰ型，Ⅶ型仅1例，占9.09 %，防治重点在Ⅱ型和Ⅰ型血清型，与之不同的是Ⅶ型发病不多，混合感染会造成较大的伤亡，应引起重视。

2.3.2 大肠杆菌血清型鉴定结果与分析 利用玻板凝集试验，测定血清型，结果显示：大肠杆菌的血清型较为复杂，凝集试验结果显示，O78仅有一例，其余血清型分别为O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，此外一例检测结果为多凝集，无法准确判定。分离到的19 种血清型全不相同，给免疫带来极大的困扰。

3 讨论

本试验发现徐州地区鸭疫里默氏杆菌主要血清型为Ⅱ型，占63.64 %;其次为Ⅰ型，占27.27 %;Ⅶ型仅一例，占9.09 %，与往年调查趋势大致相同[4]，亦与我国主流血清型相同[5]。大肠杆菌的血清型较为复杂，很多报道都认为O78为优势血清型[6]，凝集试验结果显示，O78血清型并不是本地优势血清型，分离到的19 种血清型全不相同，给免疫带來极大的困扰。

浆膜炎的防治应该从管理措施、免疫防治和药物治疗三个方面着手[7]。在临床病例描述中，发现鸭群饲养密度和卫生条件与浆膜炎的发生密切相关，因而保持合适的饲养密度和改善鸭场卫生条件对浆膜炎的预防至关重要。接种疫苗可以有效预防浆膜炎的发生，对于鸭疫里默氏杆菌，徐州地区的养殖户可以选择Ⅱ型和Ⅰ型疫苗进行接种，大肠杆菌血清型复杂，应该尝试新型疫苗，例如转基因疫苗等，能够抵抗不同血清型的侵扰。鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌耐药性增加，在临床治疗中，应根据药敏试验结果选择用药，不能长时间使用同一种药物，也可选择中药进行预防治疗。

4 结论

大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌是引起浆膜炎的主要原因，江苏徐州地区2019年度，鸭疫里默氏杆菌主要流行的血清型为Ⅱ型和Ⅰ型，偶见Ⅶ型，而分离到的19种大肠杆菌的血清型分别为O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O78、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，各不相同。

参考文献：

[1]  唐彩琰，Sara Perez.鸭疫里默氏杆菌感染的全球重要性[J].国外畜牧学（猪与禽），2017，37（10）：21-22.

[2] 沈贵荣，杨月萍.鸭传染性浆膜炎流行特点及防控措施[J].畜牧兽医科学（电子版），2019（19）：107-108.

[3] 覃春伦.药物防治鸭病讲究多[J].吉林畜牧兽医，2015，36（07）：43-44.

[4] 王书峰.鸭传染性浆膜炎的流行病学、鉴别及防治措施[J].现代畜牧科技，2019（11）：112-113.

[5] 钱学智.徐州地区鸭疫里默氏杆菌病的流行病学调查[J].中国畜禽种业，2011，7（11）：126-129.

[6] 吴彩艳，程淑琴，张建峰，等.我国鸭疫里氏杆菌病流行概述[J].动物医学进展，2017，38（06）：86-90.

[7] 苏敬良，黄瑜，胡薛英.鸭病学[M].北京：中国农业大学出版社，2016，12：243，268.