干蟾皮炮制前后两种毒性成分的含量比较*

周 谧，朱 琳，傅兴圣

1 南通市食品药品监督检验中心，南通 226006；2 三明市尤溪县中医医院，福建三明365000

干蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor 的干燥皮[1]。干蟾皮辛、凉，有毒，具有清热解毒、利水消胀之功效，临床用于治疗小儿疳积、咽喉肿痛、肿瘤；外治痈肿疔疮。干蟾皮的化学成分较复杂，主要含有蟾蜍毒素，为多种强心甾体化合物的总称，在干燥加工过程中分解为蟾毒配基类成分，主要包括华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、日蟾毒它灵等，具有一定的毒性[2]。临床大多使用其炮制品，以砂炒为主，炮制后毒性降低，但缺乏炮制降毒机理的研究支持。前期曾采用高效液相色谱法对干蟾皮和炒干蟾皮中的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、日蟾毒它灵、沙蟾毒精等5 种毒性成分进行测定，其中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基这两种成分含量较高，分离效果较好；而蟾毒灵、日蟾毒它灵、沙蟾毒精这3 种成分在炒干蟾皮中的含量极低，难以进行比较。本文采用高效液相色谱法对华蟾酥毒基、脂蟾毒配基这两种主要毒性成分进行含量测定[3，4]，比较干蟾皮炮制前后两种成分含量的变化，同时综合分析炮制后毒性降低的机理。

1 仪器与药品、试剂

Ulimate 3000 型双三元高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CP225D 电子分析天平（德国Sartorius 公司）。

脂蟾毒配基对照品（批号：110718-201108）、华蟾酥毒基对照品（批号：110803-200605）均为中国药品生物制品检定所提供；蟾毒灵（批号：CAS＃465-21-4 W05D6Z7090）为上海倍卓科技公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；水为纯化水。

本实验共收集了10 批生品（产地：S1、S2、S8 为南通如东，实地收集：S3～S7、S9、S10 为安徽亳州药材市场）和8 批炮制品（产地：C1、C2、C8 为安徽亳州药材市场，C3 为南通如东，实地收集：C4、C7 为南通市精华制药，C5 为南通市三越中药饮片公司，C6为江苏华康中药饮片公司），经由南通市食品药品监督检验中心龚旭东主任中药师鉴定确认。

2 方法与结果

2.1 样品的炮制

干蟾皮饮片（生品）：取原药材，除去杂质及灰屑，切去头爪，切成小块或片，洗净，干燥。制干蟾皮饮片（砂炒）：取砂子置锅内，用武火炒热后加入净干蟾皮块，拌炒至焦黄发泡时，取出，筛去砂子，放凉[5]。饮片见图1。

图1 干蟾皮样品图

2.2 色谱条件

色谱柱：DIKMA C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.5%磷酸二氢钾（50∶50）（用磷酸调节pH值3.2）；柱温：30 ℃；检测波长：296 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品各10 mg，分别置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密吸取贮备液各5 mL，置同一50 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 供试品溶液取干蟾皮粉末（粗粉）约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声振荡处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 空白溶液取甲醇作为空白溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，结果显示，空白溶液在与华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品色谱峰保留时间处无色谱峰，表明空白溶剂对测定没有干扰。

2.4 方法学验证

2.4.1 系统适用性要求理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于10000，相邻色谱峰之间分离度均符合要求。见图2。

图2 高效液相色谱图

2.4.2 线性关系制备分别精密吸取“2.3.1”对照品溶液适量,配制成华蟾酥毒基浓度分别为1.02、2.04、5.09、10.18、25.44、50.88 μg·mL-1，脂蟾毒配基浓度分别为0.97、1.94、4.85、9.71、24.27、48.54 μg·mL-1的系列混合对照品溶液，分别进样20 μL，记录峰面积，以浓度（μg·mL-1）为横坐标X，以峰面积（mAu）为纵坐标Y，绘制标准曲线。华蟾酥毒基回归方程为Y=11.203X+0.022，r=0.9999；脂蟾毒配基回归方程为Y=10.895X-0.151 5，r=0.999 9。结果表明，华蟾酥毒基对照品浓度在1.02～50.88 μg·mL-1、脂蟾毒配基对照品浓度在0.97～48.54 μg·mL-1呈现良好的线性关系。

2.4.3 进样精密度试验取一定浓度的对照品溶液20 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果华蟾酥毒基峰和脂蟾毒配基的峰面积RSD 分别为0.21%、0.42%。

2.4.4 稳定性试验取同一份干蟾皮供试品溶液（S2），分别于0、1、2、4、6、12、24、36、48 h 进样20 μL，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面积的RSD 分别为0.42%和0.67%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

2.4.5 专属性考察在“2.2”项色谱条件下，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基均峰形良好，无杂质干扰，保留时间分别为12.6 min、13.5 min。

2.4.6 重复性试验取同一批干蟾皮供试品（S8）1.5 g，共6 份，分别精密称定，依法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定。结果华蟾酥毒基含量的RSD 为1.45%，脂蟾毒配基含量的RSD 为2.34%。

2.4.7 加样回收率试验精密称取已知含量的干蟾皮样品（S2）0.75 g，共9 份，按低、中、高浓度（每个浓度3 份，低、中、高浓度分别为0.8∶1、1∶1、1∶1.2）分别加入三个浓度的混合对照品溶液，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。注：华蟾酥毒基平均回收率：99.49%，RSD 2.64%；脂蟾毒配基平均回收率：97.30%；RSD 1.85%

表1 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基加样回收率试验结果（n=9）

2.4.8 耐用性试验选择不同厂家色谱柱（DIKMA C18，250mm×4.6mm，5μm；Waters C18，250mm×4.6mm，5 μm 和Merck C18，150 mm×4.6 mm，5 μm）及不同型号的高效液相色谱仪（戴安Ulimate3000 双三元；岛津LC-20A 和安捷伦1200）测定各供试品，结果显示，不同厂家色谱柱和不同型号的仪器均能对样品进行较好分离，适用性良好。

2.5 样品测定

分别取不同产地的10 批生品（S1～S10）和8 批炮制品（C1～C8），按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，进样高效液相色谱仪，测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的色谱峰面积，用线性关系计算含量，以干燥品计，结果见表2。

表2 干蟾皮样品来源及含量测定结果

3 讨论

在10 批干蟾皮生品和8 批干蟾皮炮制品中，2种成分的含量差异较大，表明干蟾皮的质量参差不齐；干蟾皮药材S1、S2 为产地采集，2 项指标均高于市场收集批次，差异明显；制干蟾皮饮片C4、C7 为南通市精华制药生产，2 项指标均高于其他收集批次，差异明显。在干蟾皮生品中，华蟾酥毒基的含量为0.14～1.74 mg·g-1，均值为0.53 mg·g-1；脂蟾毒配基的含量为0.02～3.16 mg·g-1，均值为0.75 mg·g-1；制蟾皮中华蟾酥毒基的含量为0.02～0.41 mg·g-1，均值为0.17 mg·g-1；脂蟾毒配基的含量为0.004～0.87 mg·g-1，均值为0.22 mg·g-1。检测表明，在炮制品中，2 种毒性成分的含量低于生品。此外，有3 批生品（S6、S7、S8）委托南通市三越中药饮片公司炮制，生品与相应炮制品测定结果显示，2 种毒性成分经过炒制均呈不同程度的降低，华蟾酥毒基平均下降46%，下降程度在批间相差不大；脂蟾毒配基平均下降65%，下降程度在批间相差很大。逻辑性的表明，炒制后毒性降低。

干蟾皮药材有着较好的疗效，但也存在一定的毒性作用，通过炮制，则可降低其毒性，保证使用后既达到应有的疗效，又不致产生不良反应。华蟾酥毒基和脂蟾毒配基既是毒性成分，也是药效成分。通过对炮制前后干蟾皮中的这2 种毒性成分的比较研究，炮制后其含量有不同程度的降低，与干蟾皮炮制减毒的目的相符。干蟾皮炮制减毒的机理之一是通过砂炒加热，使毒性成分含量下降。本实验首次开展的干蟾皮炮制减毒机理研究，为干蟾皮安全有效、稳定可控应用提供理论基础。